1.  产品介绍

（Recombinant Peptostreptococcus magnus Protein L，简称r-PPL、蛋白L）偶联在高度交联的琼脂糖凝胶上的一种亲和纯化介质。大消化链球菌蛋白L（PPL）能与抗体的κ轻链结合而不会影响抗体的抗原结合位点，这一特性使其与结合抗体Fc区域的蛋白A、蛋白G相比，能更广泛地结合各种来源及亚类的抗体。如人类的IgG、IgM、IgA、IgE、IgD，以及含κ轻链（人类1、3、4型，小鼠1型）的Fab、scFv 等抗体片段。但不能与重链、λ轻链、κ轻链（2型）结合，因而本产品不能纯化牛、山羊、绵羊、鸡来源的抗体。

2 、产品特点与技术指标

注：a90%体积以上的微球在此粒径范围；bDBC10%测试条件为：10%流穿，6 min 停留时间；c 推荐流速是指该流速可满足大部分柱高下2~6 min 停留时间的使用条件，并非只能在该流速范围内工作；d 10 cm 柱高下的测试流速。

3、 不同配基与抗体的结合力

蛋白L与蛋白A、蛋白G对各类抗体的亲和力差异如下表所示。

注：-表示不结合；+表示微弱结合；++表示中等结合；+++表示很强结合；NA表示暂无数据。能用于亲和纯化的抗体一般需要中等以上的结合力。

4 、使用方法参考

4.1  色谱柱装填

以下阐述与层析系统连接时，填料的色谱柱装填方法。

（1）所有需要用到的材料的温度要与色谱操作的温度一样，液体做脱气处理。

（2）填料用量计算：通过沉降定量填料体积，需要的沉降填料体积=柱体积×压缩比（也称压缩因子）。沉降体积是指填料在20%乙醇保存液中自然沉降完-全读取的稳定体积。ProLNUPharoseFF的压缩比为1.15。为使达到装柱比，可通过柱头下压的方法，也可以通过高流速压柱。

（3）填料清洗：将填料悬液充分摇匀后量取相应体积，抽滤除去液体，并用约3倍填料体积的纯化水洗涤，重复3次，以除去保存液。也有用20%乙醇+0.4M NaCl作为装柱液的应用案例。

（4）装柱填料悬液准备：将填料转移到适当的容器中，加入适量的装柱液，制成50~75 v%的装柱填料悬液，使用前搅匀。

（5）装填前准备：在清洗干净的层析柱下端加入装柱液，以除去下垫片及层析柱下 端的空气，在柱内保留少量的蒸馏水，拧紧下堵头，调整柱子使其垂直于地面。

（6）装填：将搅匀后的填料悬液一次性缓慢倒入层析柱内（必要时使用装柱器），为避免引入气泡，应使之沿层析柱内壁自然流下。将所有填料加入后，用装柱液将装柱器加满，拧紧装柱器上盖，将柱子与层析系统连接。

（7）压柱：使柱内填料自然沉降（或 50~150 cm/h 的低流速下沉降），待填料沉降完-全后（填料与液体的界面清晰），去除装柱器，装上上柱头，并将柱头下降至界面处；通过高流速（推荐流速见下表，注意柱压不超过0.3MPa），继续压柱至界面清晰稳定，标记界面稳定时的柱高。停泵，打开柱头上的阀门/堵头，关闭柱底的阀门/堵头，下压柱头至标记位置下方与压缩比对应的位置，旋紧柱头，装柱完成。装柱完成后，需用高流速平衡柱内的填料。

4.2 柱效测定和评价

完成装柱后、使用前可通过柱效测定和评价可以确认层析柱装填质量。柱效通常用理论塔板高度（HETP）和非对称因子（As）来评价。柱效测定可以采用丙酮或者NaCl作为样品进行，按照下表配制样品溶液和流动相。

根据UV 或者电导率曲线计算理论塔板高度（HETP）、理论塔板数（N）和非对称因子（As），公式如下：

HETP=L/N

N=5.54(VR/Wh)2 As=a/b

其中：L为柱高；VR为保留体积；Wh为半高峰宽；a为在10%峰高处的个半峰宽；b为在10%峰高处的第二个半峰宽。

一般来说，HETP的数值应小于填料平均粒径的三倍（即HETP/D50<3，D50为填料的平均粒径），As应在0.8~1.5之间。

4.3 平衡与上样（Equilibration & Loading）

PB缓冲液（20 mM PB+150 mM NaCl，pH=7.0~7.4）是较为常用和通用的缓冲体系。初始的缓冲液称为平衡缓冲液，记为缓冲液A。

在上样前，需用缓冲液A在操作流速下平衡层析柱，该过程通常需要5~10个柱体积的缓冲液A，以电导、pH等检测信号参数不变且与缓冲液A对应为准。

上样量可按“mg 目标蛋白/mL填料”来设定，通常为DBC10%的50~80%，例如ProL NUPharose FF产品对人IgG的DBC10%为~40mg/mL，上样量可控制为20~32mg/mL。在条件筛选阶段，也可以降低上样品，观察结合、特异性和洗脱情况。上样前需要对样品进行离心（10000 g 以上）、过（0.22或0.45μm）处理，以免堵塞色谱柱。

上样后需要3~10个柱体积的缓冲液A再平衡层析柱。

4.4 洗脱与再生（Elution & Regeneration）

*-常用的洗脱方式为pH=2.5~3.0的甘-氨酸、柠檬酸盐或乙酸盐，该条件可基本将抗体完-全洗脱。但该pH较低，可能会使一些抗体失活或聚集，在条件筛选阶段可逐步降低pH，筛选出收率可接受、抗体不失活或不聚焦的pH。也可以将洗脱液收集在弱碱性的缓冲液中，中和至中性，以缩短低pH条件的接触时间。洗脱之后，可用 5~10个柱体积的洗脱液对色谱柱进行再生。

4.5 在位清洗（CIP）

ProLNUPharose FF可耐受15 mM NaOH的CIP过程（至少2个柱体积，10~30 min的接触时间），再立即用5个柱体积以上的缓冲液A平衡。

多次使用后会有沉淀蛋白，强疏水性蛋白，脂蛋白，脂质体等非特异吸附凝胶上，可以用0.1%去垢剂短时间清洗，如0.1% Triton X-100 清洗2个柱体积，立即用结合缓冲液洗5-10个柱体积。也可以用70%乙醇清洗作同样清洗。

4.6 填料保存

填料的初始保存液为20%乙醇，使用过后可继续用20%乙醇保存。保存温度在2~8℃为宜，不可冻存。