1 、产品介绍

Biotin NUPharose FF 是一种将D-生物-素键合在NUPharose琼脂糖基球上形成的亲和层析分离介质。该介质中的生物-素配基能高度特异性结合亲和素、链霉亲和素，亲和力非常高，可用于亲和素、链霉亲和素及其偶联物的固定化，固定化后的产品可应用于诊断检测，蛋白纯化等。也可直接用于削弱亲和力的亲和素、链霉亲和素突变体的纯化。

2 、产品特点与技术指标

注：a90%体积以上的微球在此粒径范围；bDBC10%测试条件为：10%流穿，6 min 停留时间。

3 、生物-素填料亲和原理

Biotin NUPharose FF填料是在NUPharose 琼脂糖凝胶微球骨架上修饰D-生物-素而成（图1a）。D-生物-素与链霉亲和素之间的亲和力非常高，其解离常数在10−14mol/L数量级，是自然界*-强的非共价相互作用。

本产品特异性结合链霉亲和素后非常稳定，只有在苛刻的条件下，例如 2%SDS的变性条件才能将链霉亲和素解离。因此Biotin NUPharose FF适用于亲和素、链霉亲和素及其偶联物的固定化，固定化后的产品可应用于诊断检测、蛋白纯化等。

另外一方面，一些链霉亲和素的突变体与D-生物-素之间的亲和力大幅减弱，使得突变体与D-生物-素的特异性结合是可逆的（图1c），因而可以用Biotin NUPharose FF来纯化链霉亲和素突变体（图2）。

4 、使用方法参考 

4.1  色谱柱装填以下阐述与层析系统连接时，填料的色谱柱装填方法。

（1）所有需要用到的材料的温度要与色谱操作的温度一样，液体做脱气处理。

（2）填料用量计算：通过沉降定量填料体积，需要的沉降填料体积=柱体积×压缩比（也称压缩因子）。沉降体积是指填料在20%乙醇保存液中自然沉降完-全读取的稳定体积。Biotin NUPharose FF 的压缩比为1.15 。为使达到装柱比，可通过柱头下压的方法，也可以通过高流速压柱。

（3）填料清洗：将填料悬液充分摇匀后量取相应体积，抽滤除去液体，并用约3倍填料体积的纯化水洗涤，重复3次，以除去保存液。

（4）装柱填料悬液准备：将填料转移到适当的容器中，加入适量的装柱液，制成50~75 v%的装柱填料悬液，使用前搅匀。

（5）装填前准备：在清洗干净的层析柱下端加入装柱液，以除去下垫片及层析柱下端的空气，在柱内保留少量的蒸馏水，拧紧下堵头，调整柱子使其垂直于地面。

（6）装填：将搅匀后的填料悬液一次性缓慢倒入层析柱内（必要时使用装柱器），为避免引入气泡，应使之沿层析柱内壁自然流下。将所有填料加入后，用装柱液将装柱器加满，拧紧装柱器上盖，将柱子与层析系统连接。

（7）压柱：使柱内填料自然沉降（或50~150 cm/h的低流速下沉降），待填料沉 降完-全后（填料与液体的界面清晰），去除装柱器，装上上柱头，并将柱头下降至界面处；通过高流速（推荐流速见下表，注意柱压不超过0.3 MPa），继续压柱至界面清晰稳定，标记界面稳定时的柱高。停泵，打开柱头上的阀门/堵头，关闭柱底的阀门/堵头，下压柱头至标记位置下方与压缩比对应的位置，旋紧柱头，装柱完成。装柱完成后，需用高流速平衡柱内的填料。

4.2  柱效测定和评价

完成装柱后、使用前可通过柱效测定和评价可以确认层析柱装填质量。柱效通常用理论塔板高度（HETP）和非对称因子（As）来评价。

4.3  推荐缓冲液

推荐用以下缓冲液结合链霉亲和素或者纯化链霉亲和素突变体。

结合缓冲液：20 mM Tris-HCl，150 mM NaCl，1 mM EDTA，pH8.0

洗脱缓冲液：结合缓冲液+10~50 mM D-生物-素再生缓冲液：0.1 M NaOH

4.4 样品纯化

（1）平衡：再用结合缓冲液平衡5个柱体积，建议流速为100~150 cm/h。

（2）上样：将准备好的样品上柱，建议流速为20~ 00cm/h ，可根据实际结合情况选择流速，能获得较好的效果。上柱的样品应尽量保持与结合缓冲液一致。通常可用透析、超滤、稀释等方法处理样品。并且上柱前应过 0.45μm 滤膜或高速离心去除 不溶物。

（3）再平衡：上样后用结合缓冲液平衡5~10个柱体积，或平衡至基线，洗去 杂质，推荐流速为100~150 cm/h。

（4）洗脱：用洗脱缓冲液洗6~10个柱体积，建议流速为100~150 cm/h,根据需要置换缓冲液。

（5）NaOH再生：洗脱目的蛋白后的柱子用纯水清洗3-5个柱体积，并用0.1 M NaOH 再生 3-5 个柱体积，再用纯水清洗至中性，用 20%乙醇保存柱子，或用结合缓冲液平衡后进行下一次纯化，建议流速为100~150 cm/h。

4.5 填料保存

填料的初始保存液为20%乙醇，使用过后可继续用20%乙醇保存。保存温度在2~8 ℃为宜，不可冻存。