1 、产品介绍

IMAC NUPharose HP是含次氮基三乙酸（NTA）基团的金属螯合填料，主要用于带组-氨酸标签（His-tag）蛋白的亲和层析。HP为High Performance的缩写，意为高分辨，微球的平均粒径为~35μm。IMAC NUPharose HP未螯合金属离子，用户可螯合Ni2+、Co2+、Cu2+、Zn2+等金属离子后使用，也提供螯合后可直接使用的填料及相应的预装柱，螯合Ni2+的产品为Ni-NTANUPharose HP。

通过配基修饰过程的优化，产品做到了亲和力和特异性的平衡：对带组-氨酸标签蛋白的结合量大于50 mg/mL的同时，一步纯化后样品纯度可达90%以上。除了组-氨酸，金属螯合填料也可与色-氨酸、半胱-氨酸残基形成配位结合，因而这款填料也可用于纯化不带标签但含这些氨基酸残基的蛋白，例如人脱铁转铁蛋白。

与亚氨基二乙酸（IDA）配基相比，NTA配基的性能更加均衡，具有如下特点。

l 对螯合剂、还原剂、碱等试剂的耐受性更好。例如样品中含有1mM EDTA、1~10 mM β-巯基乙醇或5 mM DTT时，可用Ni-NTANUPharose FF正常纯化，纯化后可用0.1~1 M NaOH清洗。

l 纯化过程洗脱液中脱落的金属离子可低至ppb（10-12）级，脱落的金属离子相对于目标蛋白的摩尔比可低于 0.1。

2 、产品特点与技术指标

注：a90%体积以上的微球在此粒径范围；bDBC10%测试条件为：10%流穿，大肠杆菌表达带组氨 酸标签的重组蛋白，6 min 停留时间；c 10 cm 柱高下的测试流速；d 剥离金属离子后 CIP 过程的 pH 稳定性

表中为几款金属螯合填料对各种溶液环境的耐受性测试（静态结合载量测试结果），其中

√表示基本不影响或降低 5%以内

!表示略有影响，降低 15%以内，可使用

!!表示有影响，降低 30%以内，使用需注意

×表示影响大，降低 30~50%，不建议使用

××表示影响很大，降低 50%以上，无法使用

注：a 样品中直接加入试剂，其中 20 mM TCEP 的影响原因是直接加 TCEP 对 pH 有较大影响， EDTA-2Na 的影响原因是剥离 Ni2+ ；b 填料用试剂处理至少 2 h，清洗后填料的性能。

 3 、金属螯合亲和层析

金属离子亲和层析是基于蛋白质分子表面的组-氨酸的咪唑基、半胱-氨酸的巯基和色-氨酸吲哚基能与Cu2+、Ni2+、Zn2 、Co2+和Ca2+形成稳定的配位结合而进行生物大分子分离纯化的过程。其中，以Ni2+为螯合离子来纯化6个组-氨酸组成的标签蛋白*为常见，本说明书也以该体系为例简要阐述次氮基三乙酸（NTA）基团的亲和原理（图1）。

NUPharose基球修饰上NTA配基后，该配体拥有四个配位基团，其中一个氮原子和三个氧原子可以与Ni2+形成牢固的螯合物。Ni2+可形成6配位数的八面体结构，剩余的两个自由配位点可以与溶剂分子或蛋白质分子结合。Ni2+与组-氨酸标签蛋白的两个组-氨酸残基的咪唑基团配位结合的过程即为金属螯合填料与目标蛋白的特异性结合过程。提高缓冲液中咪唑的浓度可以将目标蛋白洗脱，洗脱过程中咪唑和目标蛋白竞争与Ni2+的结合。降低pH会影响金属离子与配体的结合，因此改变pH也是金属螯合层析洗脱过程的方式，但pH不宜低 4，pH过低会将剥离金属离子。

金属离子亲和层析过程的非特异性吸附可能会来自离子相互作用、金属离子与含组-氨酸、半胱-氨酸、色-氨酸蛋白之间的相互作用。前者通过提高缓冲液的离子强度得到抑制，通常添加500 mM的NaCl；后者可在上样缓冲液中添加少量的咪唑（例如~5mM）或者在冲洗过程中添加咪唑而除去。经过优化，可以得到样品纯度和收率均较高的结果。

IMAC NUPharose HP填料在使用过程中金属离子掉落量少，可连续使用多次。当填料性能明显下降后可以用EDTA将原金属离子剥离，重新螯合镍后再生使用。

4 、使用方法参考 

4.1 色谱柱装填

以下阐述与层析系统连接时，填料的色谱柱装填方法。

（1）所有需要用到的材料的温度要与色谱操作的温度一样，液体做脱气处理。

（2）填料用量计算：通过沉降定量填料体积，需要的沉降填料体积=柱体积×压缩比（也称压缩因子）。沉降体积是指填料在20%乙醇保存液中自然沉降完-全读取的稳定体积。IMAC NUPharose HP和Ni-NTANUPharose HP的压缩比为~1.20。为使达到压缩比，可通过柱头下压的方法，也可以通过高流速压柱。

（3）填料清洗：将填料悬液充分摇匀后量取相应体积，抽去液体，并用约3倍填料体积的纯化水洗涤，重复3次，以除去保存液。

（4）装柱填料悬液准备：将填料转移到适当的容器中，加入适量的装柱液，制成50~75 v%的装柱填料悬液（原包装中填料体积分数为67%），使用前搅匀。