1 、产品介绍

IDA NUPharose HP 是含亚氨基二乙酸（iminodiacetic acid，IDA）基团的金属螯合填料，适用于大部分带组-氨酸标签（His-tag）蛋白的亲和层析。，HP为High Performance的缩写，意为高分辨，微球的平均粒径为~35μm。IDANUPharose HP未螯合金属离子，用户可螯合Ni2+、Co2+、Cu2+、Zn2+ 等金属离子后使用。

通过独-特的配基修饰工艺，这款产品做到了亲和力和特异性的平衡：对大部分带组-氨酸标签蛋白的结合量大于50 mg/mL的同时，一步纯化后样品纯度可达90%以上。

2 、产品特点与技术指标

注：a90%体积以上的微球在此粒径范围；bDBC10%测试条件为：10%流穿，大肠杆菌表达带组-氨酸标签的重组金黄色-葡萄球菌蛋白A，6 min 停留时间；c 10 cm 柱高下的测试流速；d 未螯合金属离子状态下的pH 稳定性。

 3 、金属螯合亲和层析——IDA

金属螯合亲和层析是基于蛋白质分子表面的组氨-酸的咪唑基、半胱-氨酸的巯基和色-氨酸吲哚基能与Cu2+、Ni2+、Zn2+、Co2+等金属离子形成稳定的配位结合而进行生物大分子分离纯化的过程。其中，以Ni2+为螯合离子来纯化6个或更多组-氨酸组成的Hig-tag标签蛋白*为常见，本说明书也以该体系为例简要阐述IDA NUPharose HP的亲和原理（图 1）。

NUPharose基球修饰上IDA配基后，该配体拥有三个配位基团，其中一个氮原子和两个氧原子可以与Ni2+形成牢固的螯合物。Ni2+可形成6配位数的八面体结构，剩余的三个自由配位点可以与溶剂分子或蛋白质分子结合。Ni2+与组-氨酸标签蛋白的组-氨酸残基的咪唑基团配位结合的过程即为金属螯合填料与目标蛋白的特异性结合过程。提高缓冲液中咪唑的浓度可以将目标蛋白洗脱，洗脱过程中咪唑和目标蛋白竞争与Ni2+的结合。降低pH会影响金属离子与配体的结合，因此改变pH也是金属螯合层析洗脱过程的方式，但pH不宜低于4，pH过低会将剥离金属离子。通常也用pH4的醋酸钠缓冲液清洗螯合Ni2+后的填料，以除去未稳定螯合的Ni2+。

金属离子亲和层析过程的非特异性吸附可能来自离子相互作用、金属离子与含组-氨酸、半胱-氨酸、色-氨酸的杂蛋白之间的相互作用。前者通过提高缓冲液的离子强度得到抑制，通常添加500mM的NaCl；后者可在上样缓冲液中添加少量的咪唑（例如~5mM）或者在冲洗过程中添加咪唑而除去。经过优化，可以得到样品纯度和收率均较高的结果。Ni-IDA NUPharose HP填料在使用过程中Ni2+脱落量少，可连续使用多次。当填料性能明显下降后可以用EDTA将原金属离子剥离，重新螯合镍后再生使用。不同金属离子对目标蛋白的亲和力与特异性不同，Cu2+、Ni2+、Zn2+、Co2+的亲和力依次降低（影响产率），特异性依次升高（影响纯度），可根据分离需求选定合适的金属离子。对于大多带Hig-tag标签的重组蛋白，Ni2+通常是首先考虑的金属离子，建议使用螯合Ni2+的Ni-IDANUPharose HP。对于含组-氨酸、半胱-氨酸或色-氨酸的非标签蛋白，Cu2+的高亲和力有利于结合目标蛋白。对于磷蛋白，可考虑使用四价或者三价离子。值得注意的是，上述规律不总是成立，需根据目标蛋白筛选合适的金属离子。

4 、使用方法参考

 4.1  色谱柱装填

以下阐述与层析系统连接时，填料的色谱柱装填方法。

（1）所有需要用到的材料的温度要与色谱操作的温度一样，液体做脱气处理。

（2）填料用量计算：通过沉降定量填料体积，需要的沉降填料体积=柱体积×压缩比（也称压缩因子）。沉降体积是指填料在20%乙醇保存液中自然沉降完-全读取的稳定体积。IDANUPharose HP 的压缩比为~1.20。为使达到装柱比，可通过柱头下压的方法，也可以通过高流速压柱。

（3）填料清洗：将填料悬液充分摇匀后量取相应体积，抽滤除去液体，并用约3倍填料体积的纯化水洗涤，重复3次，以除去保存液。

（4）装柱填料悬液准备：将填料转移到适当的容器中，加入适量的装柱液，制成50~75 v%的装柱填料悬液，使用前搅匀。

（5）装填前准备：在清洗干净的层析柱下端加入装柱液，以除去下垫片及层析柱下 端的空气，在柱内保留少量的蒸馏水，拧紧下堵头，调整柱子使其垂直于地面。

（6）装填：将搅匀后的填料悬液一次性缓慢倒入层析柱内（必要时使用装柱器）， 为避免引入气泡，应使之沿层析柱内壁自然流下。将所有填料加入后， 用装柱液将装柱 器加满，拧紧装柱器上盖，将柱子与层析系统连接。

（7）压柱：使柱内填料自然沉降（或50~150 cm/h的低流速下沉降），待填料沉降完-全后（填料与液体的界面清晰），去除装柱器，装上上柱头，并将柱头下降至界面处；通过高流速（推荐流速见下表，注意柱压不超过0.3MPa），继续压柱至界面清晰稳定，标记界面稳定时的柱高。停泵，打开柱头上的阀门/堵头，关闭柱底的阀门/堵头，下压柱头至标记位置下方与压缩比对应的位置，旋紧柱头，装柱完成。装柱完成后，需用高流速平衡柱内的填料。

4.2  柱效测定和评价

完成装柱后、使用前可通过柱效测定和评价可以确认层析柱装填质量。柱效通常用理论塔板高度（HETP）和非对称因子（As）来评价。

4.3  螯合金属离子

IDA NUPharose HP 以未螯合金属离子的形式出售，用户可以在装柱完成后再层析柱中螯合金属离子，螯合过程参照以下步骤。

（1）配制50~200 mM的金属离子溶液，例如螯合Ni2+通常用NiSO4。螯合Ni2+、 Cu2+、Co2+、Zn2+等不同离子的过程基本相同，需注意控制不同pH条件下不同金属离子的溶解性，pH过高可导致沉淀。螯合Zn2+时，需控制pH=5.5或者更低；螯合Fe3+时，需控制pH=3.0左右。

（2）用纯水清洗色谱柱，纯水用量 3~5 CV（柱体积），流速100~200cm/h。

（3）用0.2~0.8 CV 的金属离子溶液通过色谱柱，流速50~100 cm/h金属离子过量50%时足够螯合完-全。例如 IDANUPharose HP可螯合18 μmol Ni2+/mL，用0.6 CV的50mM NiSO4溶液螯合时，Ni2+过量67%。螯合完-全后色谱柱底部的颜色从白色变为螯合特定金属离子的颜色。

（4）用纯水清洗色谱柱除去过量的金属离子，纯水用量至少5CV，流速100~200cm/h。

（5）用20mM醋酸钠+0.5M NaCl（pH=4.0）缓冲液将螯合不稳定的金属离子除去，缓冲液用量至少5 CV，流速100~200 cm/h。

（6）可直接用结合缓冲液平衡色谱柱。

在装柱前螯合金属离子的过程与上述在色谱柱中螯合一致，可在旋匀仪、反应瓶（釜）中螯合金属离子，利用过滤器清洗螯合前后的填料。

4.4 平衡与上样（Equilibration & Loading）

金属螯合填料与磷酸盐、Tris-HCl等缓冲体系兼容，其中“20mM PB+500mM NaCl（pH=7.4）”的缓冲体系*为常用。初始的缓冲液称为平衡缓冲液，记为缓冲液A。缓冲液A的特点为不含或者含少量咪唑，pH在7~8之间居多，呈弱碱性。实际使用过程中，如果上样料液的体积特别大，从降低成本的角度考虑，可不往料液中添加咪唑和NaCl来抑制非特异性吸附，而是在上样后进行冲洗来去除杂质。

在上样前，需用缓冲液A在操作流速下平衡层析柱，该过程通常需要5~10个柱体积的缓冲液A，以电导、pH等检测信号参数不变且与缓冲液A对应为准。

上样量可按“mg目标蛋白/mL 填料”来设定，通常为DBC10%的50~80%，例如Ni-IDANUPharose HP产品对重组金黄色-葡萄球菌蛋白A（r-SPA，NRPA04）的DBC10%为~50mg/mL，纯化 r-SPA 时的上样量可为25~4mg/mL。除了DBC10%，也可以测试上样流穿液中的目标蛋白确定上样量。上样前需要对样品进行离心（10000g 以 上）或/和过滤（0.22或0.45μm）等澄清处理，以免堵塞色谱柱。样品的pH和盐浓度可用缓冲液A或浓度更高的母液调节。

上样后需要3~10个柱体积的缓冲液A再平衡层析柱

4.5  洗杂（Wash）

在缓冲液A中添加5~40mM的咪唑冲洗层析柱，可以将非特异性结合的杂蛋白除去。咪唑浓度越高，杂蛋白被除去得越彻-底，但会降低目标蛋白的收率。洗杂过程咪唑的浓度与不同蛋白的特性相关，可通过阶跃洗杂过程（例如5mM、10mM、20 mM……）快速优化洗杂条件。洗杂的体积通常为3~10个柱体积。

4.6 洗脱（Elution）

*-常用的洗脱方式为提高洗脱液中咪唑的浓度（在缓冲液A中加入咪唑），推荐在0~500mM范围内进行阶跃洗脱或者线性梯度洗脱。对于大多数带组-氨酸标签的蛋白，200mM的咪唑浓度可以将目标蛋白洗脱完-全。对于一些场合，也可以改变pH，结合较弱的蛋白可在pH6时可洗脱，结合较强的蛋白可在pH6~4时洗脱，需注意pH不能低于4。

4.7 再生（Regeneration）

在多次使用后，需要对填料进行再生。可以选择0.5~1柱体积200mM EDTA+500 mM NaCl（pH=7）的缓冲液将金属离子剥离。再用50~200mM的金属盐溶液与IDA配基螯合，用纯水将过量的金属离子除去，用20 mM醋酸钠+0.5 M NaCl（pH=4.0）缓冲液将螯合不稳定的金属离子除去。金属离子的重新螯合参照4.3小节。

4.8  在位清洗（CIP）

通常上述的再生过程可将填料彻-底清洗。若发生柱压升高，或为了避免交叉污染，将金属离子剥离后可进行在位清洗过程。可采用以下溶剂进行在位清洗：2mol/L NaCl ，1mol/L NaOH、70%乙醇或 30%异丙醇等。在位清洗可有效去除介质上的杂质，反向效果更佳。清洗后需用3~5 柱体积的纯水除去上述溶剂。

4.9 填料保存

填料的初始保存液为20%乙醇，使用过后可继续用20%乙醇保存。保存温度在2~30 ℃为宜，不可冻存。