1 、产品介绍

Blue NUPharoseFF 是一种染料亲和填料，通常称为蓝胶，Blue NUPharose FF的配基为三嗪类活性染料，特殊的结构决定了其与蛋白结合的复杂性，一般认为其通过静电相互作用、疏水相互作用以及氢键等作用力与蛋白结合，适用于脱氢酶、激酶、血浆类蛋白等的分离纯化。

2 、产品特点与技术指标

注：a90%体积以上的微球在此粒径范围；bDBC10%测试条件为：10%流穿，4 min 停留时间；c 10 cm 柱高下的测试流速。

3 、染料亲和层析原理

 Blue NUPharose FF 配基的特殊结构决定了其对蛋白质的吸附是一个复杂的过程。除对蛋白质分子上的二核苷酸链具有亲和作用外，其蒽醌杂环与蛋白质分子非极性面之间存在疏水作用，芳香环上的磺酸基又使其具有离子交换基团的性质，可能导致蛋白与配基之间存在非均一结合。

因此对于不同的蛋白及配基和蛋白之间的结合情况也不尽相同。以BSA为例，pH值的变化对其在Blue NUPharose FF上的吸附影响非常显著。随着pH值的升高，吸附容量急剧下降。主要原因是随着pH值的升高，蛋白质分子上带有正电荷的区域将减小，导致与染料之间的静电相互作用减弱，所以吸附量降低。当pH值在5.5~8.0降低时，蛋白质吸附容量的提高主要是由蛋白质分子中组-氨酸残基引起的。而BSA分子中具有较高水平的组-氨酸残基含量(17个组-氨酸残基/581残基)，所以吸附量随PH值的变化比较显著。

4 、使用方法参考

4.1 色谱柱装填

以下阐述与层析系统连接时，填料的色谱柱装填方法。

（1）所有需要用到的材料的温度要与色谱操作的温度一样，液体做脱气处理。

（2）填料用量计算：通过沉降定量填料体积，需要的沉降填料体积=柱体积×压缩比（也称压缩因子）。沉降体积是指填料在 20%乙醇保存液中自然沉降完-全读取的稳定 体积。Blue NUPharoseFF的压缩比为 1.15。为使达到装柱比，可通过柱头下压的方法，也可以通过高流速压柱。

（3）填料清洗：将填料悬液充分摇匀后量取相应体积，抽滤除去液体，并用约3倍填料体积的纯化水洗涤，重复3次，以除去保存液。

（4）装柱填料悬液准备：将填料转移到适当的容器中，加入适量的装柱液，制成50~75 v%的装柱填料悬液，使用前搅匀。

（5）装填前准备：在清洗干净的层析柱下端加入装柱液，以除去下垫片及层析柱下端的空气，在柱内保留少量的装柱液，拧紧下堵头，调整柱子使其垂直于地面。

（6）装填：将搅匀后的填料悬液一次性缓慢倒入层析柱内（必要时使用装柱器），为避免引入气泡，应使之沿层析柱内壁自然流下。将所有填料加入后，用装柱液将装柱器加满，拧紧装柱器上盖，将柱子与层析系统连接。

（7）压柱：使柱内填料自然沉降（或50~150 cm/h的低流速下沉降），待填料沉降完-全后（填料与液体的界面清晰），去除装柱器，装上上柱头，并将柱头下降至界面处；通过高流速（推荐流速见下表，注意柱压不超过0.3MPa），继续压柱至界面清晰稳定，标记界面稳定时的柱高。停泵，打开柱头上的阀门/堵头，关闭柱底的阀门/堵头，下压柱头至标记位置下方与压缩比对应的位置，旋紧柱头，装柱完成。装柱完成后，需用高流速平衡柱内的填料。

4.2  柱效测定和评价

完成装柱后、使用前可通过柱效测定和评价可以确认层析柱装填质量。柱效通常用理论塔板高度（HETP）和非对称因子（As）来评价.

4.3  平衡与上样（Equilibration & Loading）

结合缓冲液常见的磷酸盐、醋酸盐等均可作为结合缓冲液，需根据样品特点选择合适的结合缓冲液（记为缓冲液A）。根据第3章节的染料亲和层析原理，适当低的pH的结合缓冲液能促进蛋白的结合，一般情况下pH范围在5.5~8.0之间宜。

实际使用过程中，上样料液的体积往往较大，在上样前，需用缓冲液A在操作流速下平衡层析柱，该过程通常需要5~10个柱体积的缓冲液A，以电导、pH 等检测信号参数不变且与缓冲液A对应为准。

上样量可按“mg 目标蛋白/mL填料”来设定，通常为DBC10%的50~80%，例如 Blue NUPharose FF产品对BSA的DBC10%为~20mg/mL，纯化时上样量可为10~16mg/mL。 除了DBC10%，也可以测试上样流穿液中的目标蛋白确定上样量。上样前需要对样品进行离心（10000 g以上）、过滤（0.22或0.45 μm）处理，以免堵塞色谱柱，样品的pH需与上样缓冲液保持一致。

上样后需要3~10个柱体积的缓冲液 A 再平衡层析柱。

4.4  洗脱（Regeneration）

染料亲和的样品多种多样，亲和原理较为复杂，相应的洗脱方式也需随样品不同而改变。通常可以改变缓冲液的pH、离子强度（例如添加2 M NaCl）和极性（例如添加50%乙二醇）。纯化酶时可加入低浓度的辅因子进行竞争洗脱。

4.5  再生（Regeneration）

可以采用高pH（0.1MTris，0.5 M NaCl，pH 8.5）和低pH（0.1MNaAc，0.5M NaCl，pH 4.5）交替清洗4~5次去除结合较强的蛋白质使层析柱再生。

4.6  在位清洗（CIP）

通常上述的再生过程可将填料彻-底清洗。若发生柱压升高，或为了避免交叉污染，将金属离子剥离后可进行在位清洗过程。可采用以下溶剂进行在位清洗：2mol/L NaCl，1mol/L NaOH、70%乙醇或30%异丙醇等。在位清洗可有效去除介质上的杂质，反向效果更佳。清洗后需用3~5 柱体积的纯水除去上述溶剂。

4.7 填料保存

填料的初始保存液为20%乙醇，0.1mol/L KH2PO4，pH 8.0。使用过后可继续相同的溶液保存。保存温度在2~8 ℃为宜，不可冻存。