1 、产品介绍

 NuPerley rat-PA是一款抗体亲和填料，其配基rat-PA为重组耐碱蛋白A（Recombinant Alkali-tolerant Protein A，rat-PA），NuPerley基球是新一代高刚性琼脂糖微球。

重组耐碱蛋白A配基由大肠杆菌表达，不含动物来源，该配基通过多点偶联的方式与基球偶联，减少了配基掉落，通常情况下相对于抗体的配基掉落量可控制在5~10ppm以内。加之基因工程改造，其对人IgG的动态结合载量稳定在45mg/mL，可耐受0.1~0.5M浓度的NaOH溶液清洗和去除热源。相较于ProANUPharoseFF，本产品保持了对人、小鼠、大鼠、兔、牛等等来源的多种类型和亚型的抗体有亲和作用，可从腹水、血清、细胞培养上清或细胞抽提物中分离和纯化多种哺乳动物不同亚型的抗体或包含抗体Fc片段的基因工程重组蛋白，可满足不同规模的研究或生产严格的清洁要求。

2 、产品特点与技术指标

注：a90%体积以上的微球在此粒径范围；bDBC10%测试条件为：10%流穿，6 min 停留时间；c 推 荐流速是指该流速可满足大部分柱高下 2~6 min 停留时间的使用条件，并非只能在该流速范围 内工作；d 10 cm 柱高下的测试流速。

3 、使用方法参考

 3.1  色谱柱装填

以下阐述与层析系统连接时，填料的色谱柱装填方法。

（1）所有需要用到的材料的温度要与色谱操作的温度一样，液体做脱气处理。

（2）填料用量计算：通过沉降定量填料体积，需要的沉降填料体积=柱体积×压缩比（也称压缩因子）。沉降体积是指填料在20%乙醇保存液中自然沉降完-全读取的稳定体积。NuPerley rat-PA的压缩比为1.10。为使达到装柱比，可通过柱头下压的方法，也可以通过高流速压柱。

（3）填料清洗：将填料悬液充分摇匀后量取相应体积，抽滤除去液体，并用约3倍填料体积的纯化水洗涤，重复3次，以除去保存液。

（4）装柱填料悬液准备：将填料转移到适当的容器中，加入适量的装柱液，制成50~75 v%的装柱填料悬液，使用前搅匀。

（5）装填前准备：在清洗干净的层析柱下端加入装柱液，以除去下垫片及层析柱下端的空气，在柱内保留少量的蒸馏水，拧紧下堵头，调整柱子使其垂直于地面。

（6）装填：将搅匀后的填料悬液一次性缓慢倒入层析柱内（必要时使用装柱器），为避免引入气泡，应使之沿层析柱内壁自然流下。将所有填料加入后，用装柱液将装柱器加满，拧紧装柱器上盖，将柱子与层析系统连接。

（7）压柱：使柱内填料自然沉降（或 50~150 cm/h 的低流速下沉降），待填料沉降完-全后（填料与液体的界面清晰），去除装柱器，装上上柱头，并将柱头下降至界面处；通过高流速（推荐流速见下表，注意柱压不超过0.3MPa），继续压柱至界面清晰稳定，标记界面稳定时的柱高。停泵，打开柱头上的阀门/堵头，关闭柱底的阀门/堵头，下压柱头至标记位置下方与压缩比对应的位置，旋紧柱头，装柱完成。装柱完成后，需用高流速平衡柱内的填料。

3.2  柱效测定和评价

完成装柱后、使用前可通过柱效测定和评价可以确认层析柱装填质量。柱效通常用理论塔板高度（HETP）和非对称因子（As）来评价。柱效测定可以采用丙酮或者NaCl作为样品进行，按照下表配制样品溶液和流动相。

根据 UV 或者电导率曲线计算理论塔板高度（HETP）、理论塔板数（N）和非对称因子（As），公式如下：

HETP=L/N

N=5.54(VR/Wh)2 As=a/b

其中：L为柱高；VR为保留体积；Wh为半高峰宽；a为在10%峰高处的个半峰宽；b为在10%峰高处的第二个半峰宽。

一般来说，HETP的数值应小于填料平均粒径的三倍（即HETP/D50<3，D50为填 料的平均粒径），As应在0.8~1.5之间。

3.3  平衡与上样（Equilibration & Loading）

PB缓冲液（20mM PB+150 mM NaCl，pH=7.0~7.4）是较为常用和通用的缓冲体系。初始的缓冲液称为平衡缓冲液，记为缓冲液 A。

在上样前，需用缓冲液A在操作流速下平衡层析柱，该过程通常需要5~10个柱体 积的缓冲液A，以电导、pH等检测信号参数不变且与缓冲液A对应为准。

上样量可按“mg目标蛋白/mL 填料”来设定，通常为DBC10%的50~80%，例如NuPerley rat-PA产品对人IgG的DBC10%为~45 mg/mL，上样量可控制为23~36 mg/mL。在条件筛选阶段，也可以降低上样品，观察结合、特异性和洗脱情况。上样前需要对样品进行离心（10000 g以上）、过滤（0.22或0.45μm）处理，以免堵塞色谱柱。

上样后需要3~10个柱体积的缓冲液A再平衡层析柱。

3.4  洗脱与再生（Elution & Regeneration）

*-常用的洗脱方式为pH=3~4的甘-氨酸、柠檬酸盐或乙酸盐，该条件可基本将抗体完-全洗脱。但该pH较低，可能会使一些抗体失活或聚集，在条件筛选阶段可逐步降低pH，筛选出收率可接受、抗体不失活或不聚焦的pH，通常在pH=4.5~6时，抗体开始被洗脱。也可以将洗脱液收集在弱碱性的缓冲液中，中和至中性，以缩短低pH条件的接触时间。洗脱之后，可用5~10个柱体积的洗脱液对色谱柱进行再生。

3.5  在位清洗（CIP）

若发生柱压升高，或有蛋白与填料强烈结合无法洗脱，或有沉淀、变性蛋白时，需要对填料进行在位清洗，可采用以下用0.1~0.5 M 浓度的NaOH去除杂质，反向清洗效果更佳。

3.6  填料保存

填料的初始保存液为20%乙醇，使用过后可继续用20%乙醇保存。保存温度在2~8℃为宜，不可冻存。