英文名称：Rat 25-Dihydroxy vitamin D3,HVD3 ELISA Kit

货号：XFR30012

规格：48T/96T

有效期：6个月

保存条件：2-8℃

用途：本试剂盒用于体外定量检测血清、血浆、组织匀浆及相关液体样本中大鼠25羟基维-生素D（25-OH-VD）的含量。

检测原理

试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被大鼠25羟基维生-素D（25-OH-VD）捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻-底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成*终的黄色。颜色的深浅和样品中的大鼠25羟基维-生素D（25-OH-VD）呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD 值），计算样品浓度。

样品收集、处理及保存方法

以下只是列出样品采集的一般指南。所有样本采集过程中，不得使用叠氮钠做为防腐剂。

1.  血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，将收集于血清分离管的全血标本在室温放置2小时或4℃过夜，然后1000×g离心20 分钟，取上清即可，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

2.  血浆：用EDTA或肝素作为抗凝剂采集标本，并将标本在采集后的30分钟内于2-8℃ 1000×g离心15分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

3.  细胞培养物上清或其它生物标本：请1000×g离心20分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

4.  组织匀浆：用预冷的PBS (0.01M, pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液（匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果），称重后将组织-剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS（一般按1:9的重量体积比，比如1g的组织样品对应9mL的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂）加入玻璃匀浆器中，于冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎，或反复冻融。*后将匀浆液于5000×g离心5~10分钟，取上清检测。

注：标本溶血会影响*后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。

5.  保存：如果样本收集后不及时检测，请按一次用量分装，冻存于-20℃，避免反复冻融，在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。

自备物品

1. 酶标仪（450nm）

2. 高精度加样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3. 37℃恒温箱

4. 蒸馏水或去离子水

试剂盒组成

注：

1.  标准品浓度依次为：48、24、12、6、3、0 ng/mL

2.  经过大量正常标本检验，标本的正常浓度值均在试剂盒提供的检测范围内，实验过程中直接取50μL样本上样即可。当有部分样本值超过标准品浓度时，可用样本-稀释液将标本进行适当稀释后再进行实验。 

操作注意:

10. 如果样本可能传播疾病，所有的样品都应管理好，按照规定的程序处理样品和检测装置。 

试剂的准备

1.试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡后方可使用。

2. 20×洗涤缓冲液的稀释：蒸馏水按1：20稀释，即1份的20×洗涤缓冲液加19份的蒸馏水。 

洗板方法

1.  手工洗板：甩尽孔内液体，每孔加满洗涤液，静置1min后甩尽孔内液体，在吸水纸上拍干，如此洗板5次。

2.  自动洗板机：每孔注入洗液350μL，浸泡1min，洗板5次。

操作步骤

1.  从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2.  设置标准品孔和样本孔,标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

3.  待测样本孔先加待测样本50μL，空白孔不加。样本不足的情况下，上样量*少10μL。操作方法：待测样本孔先加待测样本10μL，再加样本-稀释液40μL。

4.  除空白孔外,标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5.  弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6.  每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.  每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。 

实验结果计算:

以所测标准品的OD值为横坐标，标准品的浓度值为纵坐标，在坐标纸上或用相关软件绘制标准曲线，并得到回归方程，将样品的OD值代入方程，计算出样品的浓度。

试剂盒性能

1.  检测范围：1.5 ng/mL - 48 ng/m。

2.  灵敏度：*-低检测浓度小于0.1 ng/mL。

3.  特异性：不与其它可溶性结构类似物交叉反应。

4.   重复性：板内变异系数小于10% ，板间变异系数小于15%

其他注意事项:

*终的实验结果与试剂的有效性、实验者的相关操作以及当时的实验环境密切相关，请务必准备充足的标本备份。

只有全部使用本试剂盒配套试剂才能保证检测效果，不能混用其他制造商或者不同批次的产品。严格遵守试剂盒的实验说明才会得到*佳的检测结果。

本公司只对试剂盒本身负责，不对因使用该试剂盒所造成的样本消耗负责，请使用者使用前充分考虑到样本的可能使用量，预留充足的样本。

使用化学裂解液制备的组织匀浆或细胞提取液可能会由于某些化学物质的引入导致若样本为细胞培养上清，因该类样本干扰因素较多，如：细胞状态、细胞数量、采样时间等，所以可能存在检测不出的情况。

某些天然蛋白或重组蛋白，包括原核及真核重组蛋白，可能因为与本产品所使用的检测抗体及捕获抗体不匹配，而不被检测出。

操作安全须知:

1) 所有的化学试剂理应被认为具有潜在危害,任何的操作都必须提前做好实验防护。在操作试剂盒或处理样本的区域请不要饮食。

2) 推荐只有经过良好实验室培训的工作人员方可操作本试剂盒。操作时请佩戴合适的防护设施，例如白大衣、实验手套、安全眼镜等。

3) 请不要让试剂或样本接触皮肤、眼睛和粘膜等身体部位。如不慎接触，请立即用大量清水清洗。

4) 试剂盒中的终止液为酸性溶液，在使用终止液时，请佩戴防-护服，做好防护眼睛、手及面部等的措施。 

5)检测必须符合实验室管理规范的规定，严格防止交叉污染，所有样品、洗弃液和各种废弃物都应按照实验室规定进行处置，严禁随意丢弃。

6)试剂盒的液体组分中，含有防腐剂，可能引起皮肤过敏反应，避免吸入烟雾或与皮肤接触。底物液对皮肤、眼睛和上呼吸道有刺激作用，避免吸入烟雾。戴上防护手套，实验完成后彻-底洗手。

大鼠25羟基维生-素D ELISA检测试剂盒