免疫荧光八标九色（切片）

服务介绍：

免疫荧光八标即利用酪胺信号放大（TSA，Tyramide signal amplification）即TSA技术，在同一张切片上对八种蛋白同时进行标记，从而可实现对多种蛋白空间定位，定性及半定量分析。

TSA技术主要原理为荧光标记的酪胺在二抗上偶联的HRP与H₂O₂的作用下变为活化的酪胺并附着在靶标周围的蛋白酪-氨酸残基上，此结合是共价结合。而一抗与靶标、二抗与一抗之间是非共价结合。通过抗体洗脱液处理，非共价结合的一抗二抗被洗脱掉，而共价结合的荧光酪胺依然附着在靶标周围，将靶标通过荧光标记显示出来。在检测第二个靶标时，相当于全新的一轮标记，无需考虑第二轮的抗体是否与轮的抗体产生交叉反应。只需改变不同种类荧光染料标记TSA即可实现多个靶标的标记。通过多次重复免疫标记，使用不同的荧光酪胺实现双重或多重荧光染色。

送样运输要求：

1、石蜡切片常温保存运输，冰冻切片﹣20℃保存运输

2、细胞爬片PFA固定15min后用无菌PBS洗涤，无菌PBS浸泡，4℃冰袋保存运输到实验室

实验大体流程：

石蜡切片脱蜡至水——微波抗原修复——画圈双氧水封闭——血清封闭——孵育种一抗

——孵育HRP二抗——孵育对应的TSA——抗体洗脱——血清封闭——孵育第二种一抗

——孵育HRP二抗——孵育对应的TSA——抗体洗脱——血清封闭——孵育第三种一抗

——孵育HRP二抗——孵育对应的TSA——抗体洗脱——血清封闭——孵育第四种一抗

——孵育HRP二抗——孵育对应的TSA——抗体洗脱——血清封闭——孵育第五种一抗

——孵育HRP二抗——孵育对应的TSA——抗体洗脱——血清封闭——孵育第六种一抗

——孵育HRP二抗——孵育对应的TSA——抗体洗脱——血清封闭——孵育第七种一抗

——孵育HRP二抗——孵育对应的TSA——抗体洗脱——血清封闭——孵育第八种一抗

——孵育HRP二抗——孵育对应的TSA——DAPI染核——自发荧光淬灭——抗荧光淬灭封片剂封片——扫描全景成像。

（TSA荧光染料的搭配及加样顺序根据各抗体的表达情况来确定。）

实验具体流程：

1、石蜡切片脱蜡至水：依次将石蜡切片放入环保型脱蜡液I 10min-环保型脱蜡液II 10min-环保型脱蜡液III 10min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min-无水乙醇Ⅲ 5min-蒸馏水洗。

2、抗原修复：组织切片置于盛满抗原修复缓冲液PH 6.0 柠檬酸； PH 9.0 EDTA；PH 8.0 EDTA）的抗原修复盒中于微波炉内进行抗原修复。维持缓冲液沸腾10min左右，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。自然冷却后将玻片置于PH7.4 PBS中在钟摆摇床上晃动洗涤3次，每次5min(修复液种类和修复条件根据组织来确定）。

3、画圈, 双氧水封闭：切片稍甩干后用免疫组化笔在组织周围画圈（防止试剂流走），切片平放于避光湿盒滴加3%双氧水溶液，室温避光孵育25 min左右，封闭内源性过氧化物酶。将玻片置于PH7.4 PBS中在钟摆摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

4、血清封闭:切片平放于避光湿盒滴加血清室温封闭30min。一抗是山羊来源用10%兔血清封闭，一抗其它来源的用3%BSA封闭。

5、加种一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加用无菌PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于避光湿盒内4°C孵育过夜（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）。

6、加对应种属HRP标记二抗：将玻片置于PH7.4 PBS中在钟摆摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后平放于透明湿盒在圈内滴加与一抗相应种属的HRP标记的二抗覆盖组织，室温孵育50min。

7、加对应的TSA：将玻片置于PH7.4 PBS中在钟摆摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后将切片平放于避光湿盒在圈内滴加对应的TSA，避光室温孵育10min。 孵育完后，将玻片置于TBST中在钟摆摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

至此步骤，支抗体标记完成。

8、抗体洗脱：切片稍甩干后，滴加抗体洗脱液铺满整个组织，室温孵育5 min后去除抗体洗脱液，再次滴加足量的抗体洗脱液完-全覆盖组织，37°C孵育30 min，孵育完成后将玻片置于TBST中在钟摆摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

9、血清封闭:切片平放于避光湿盒滴加血清室温封闭30min。一抗是山羊来源用10%兔血清封闭，一抗其它来源的用3%BSA封闭。

10、加第二种一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加用无菌PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于避光湿盒内4°C孵育过夜（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）。

11、加对应种属HRP标记二抗：将玻片置于PH7.4 PBS中在钟摆摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的HRP标记的二抗覆盖组织，室温孵育50min。

12、加对应的TSA：将玻片置于PH7.4 PBS中在钟摆摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后将切片平放于避光湿盒在圈内滴加对应的TSA，避光室温孵育10min。 孵育完后，将玻片置于TBST中在钟摆摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

至此步骤，第二支抗体标记完成。

备注：步骤4-7为支抗体标记过程，步骤8-12为第二支抗体标记过程，每轮抗体标记只需更换不同荧光素标记的TSA。 每标记完一支抗体，进行抗体洗脱，去除此轮标记的一抗，二抗后， 再继续下一轮的抗体标记过程。根据荧光多标的抗体数量，重复以上步骤，直至完成所有的抗体标记，再进入后续染核，淬灭自发荧光的步骤。

13、DAPI复染细胞核：切片稍甩干后将切片平放于避光湿盒在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10min。将玻片置于PH7.4 PBS中在钟摆摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

14、自发荧光淬灭：切片稍甩干后将切片平放于避光湿盒在圈内加入自发荧光淬灭剂5min，流水冲洗10min。

15、封片：将玻片置于PH7.4 PBS中在钟摆摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。