服务介绍：

抗原抗体的结合非常特异。免疫荧光双标是用两种不同种属来源的抗体共同孵育同一张组织切片，两种抗体分别与两种目标蛋白特异性结合，然后再用带有不同颜色的荧光染料标记的第二抗体分别与其对应的抗体结合，在组织切片扫描仪或者荧光显微镜下用对应波长的光去激发染料发出两种不同的荧光，进而将两种不同目标蛋白通过间接标记的方式用两种荧光显示出来。也可以利用TSA技术进行荧光标记，有信号放大的作用同时可以不限制一抗的种属，同源或异源一抗都可以标记。TSA技术主要原理为用HRP标记的第二抗体与抗体结合后，再孵育荧光标记的酪胺（TSA），TSA在二抗上偶联的HRP与H₂O₂的作用下变为活化的酪胺并附着在目标蛋白周围的蛋白酪-氨酸残基上，此结合是共价结合。而一抗与靶标、二抗与一抗之间是非共价结合。通过高温和微波处理，非共价结合的一抗二抗被打断并洗脱掉，而共价结合的荧光酪胺依然附着在靶标周围，进而将靶标通过荧光标记显示出来。每轮标记都按一抗-二抗-TSA的顺序对相应抗原进行标记，每轮染色只需改变TSA荧光染料种类即可实现多个靶标用不同荧光染料进行共同标记。在组织切片扫描仪或者荧光显微镜下用荧光染料对应波长的光去激发染料发出荧光进而将目标蛋白通过间接标记的方式显示出来。

 切片数字扫描是通过控制显微成像系统和切片以一定的规则运动，采集多张连续的高分辨率显微图像再无缝拼接生成一张高分辨率的组织切片全景图像。该图像包含了玻片上所有的信息，可在电脑上用浏览软件任意放大和缩小，任意部位观察采图，是真正脱离显微镜的阅片方式。通过在扫描仪上加载与免疫标记时荧光染料匹配的*佳激发波长和发射波长的滤光块，获取不同荧光通道的图像。可单通道，多通道任意组合浏览并按需采图。

送样运输要求：

1、组织样本放置于10倍样本体积的通用型组织固定液中固定24h以上，常温保存运输石蜡包埋切片或者冰冻切片。置于固定液内的组织切勿冷冻结冰，切勿固定时间过长。细胞爬片用通用型组织固定液固定，封口膜封好防止漏液，常温保存运输。

2、石蜡切片常温保存运输。冰冻切片-20°保存运输。

实验大体流程：

荧光二抗法：

石蜡切片脱蜡至水（冰冻切片和细胞爬片无需此步）——微波抗原修复——画圈血清封闭——同时孵育两种异源一抗——同时孵育对应种属的两种荧光二抗——DAPI染核——自发荧光淬灭——抗荧光淬灭封片剂封片——扫描全景成像。

TSA法

石蜡切片脱蜡至水（冰冻切片和细胞爬片无需此步）——微波抗原修复——画圈双氧水封闭——血清封闭——孵育种一抗——孵育HRP二抗——孵育iF555-TSA——微波处理——血清封闭——孵育第二种一抗——孵育HRP二抗——孵育iF488-TSA ——DAPI染核——自发荧光淬灭——抗荧光淬灭封片剂封片——扫描全景成像。 

荧光二抗法实验具体流程：

1、石蜡切片脱蜡至水：依次将石蜡切片放入环保型脱蜡液I 10min-环保型脱蜡液II 10min-环保型脱蜡液III 10min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min-无水乙醇Ⅲ 5min-蒸馏水洗。

2、抗原修复：组织切片置于盛满抗原修复缓冲液（PH 6.0 柠檬酸；PH 9.0 EDTA； PH 8.0 EDTA）的抗原修复盒中于微波炉内进行抗原修复。维持缓冲液沸腾10min左右，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。自然冷却后将玻片置于PH7.4 PBS中在钟摆摇床上晃动洗涤3次，每次5min(修复液种类和修复条件根据组织来确定，优先推荐 PH 6.0 柠檬酸修复液）。

3、画圈血清封闭：切片稍甩干后用免疫组化笔在组织周围画圈（防止试剂流走），切片平放于透明湿盒滴加血清室温封闭30min。一抗是山羊来源用10%兔血清封闭，一抗其它来源的用3%BSA封闭。

4、加两种异源一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加用无菌PBS按一定比例配好的两种一抗，切片平放于透明湿盒内4°C孵育过夜（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）。

5、加对应种属荧光素标记的二抗（常用iF488和CY3标记的二抗）：将玻片置于PH7.4 PBS中在钟摆摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后平放于透明湿盒在圈内滴加与两种一抗分别对应种属的荧光素标记的二抗覆盖组织，室温孵育50min。

6、DAPI复染细胞核：切片稍甩干后将切片平放于避光湿盒在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10min。将玻片置于PH7.4 PBS中在钟摆摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

7、自发荧光淬灭：切片稍甩干后将切片平放于避光湿盒在圈内加入自发荧光淬灭剂5min，流水冲洗10min。

8、封片：将玻片置于PH7.4 PBS中在钟摆摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。

9、镜检成像：切片置于玻片数字扫描仪下扫描全景成像。各种荧光素颜色及激发与发射波长见下表。

TSA法实验具体流程：

1、石蜡切片脱蜡至水：依次将石蜡切片放入环保型脱蜡液I 10min-环保型脱蜡液II 10min-环保型脱蜡液III 10min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min-无水乙醇Ⅲ 5min-蒸馏水洗。

2、抗原修复：组织切片置于盛满抗原修复缓冲液（ PH 6.0 柠檬酸； PH 9.0 EDTA；PH 8.0 EDTA）的抗原修复盒中于微波炉内进行抗原修复。维持缓冲液沸腾10min左右，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。自然冷却后将玻片置于PH7.4 PBS中在钟摆摇床上晃动洗涤3次，每次5min(修复液种类和修复条件根据组织来确定）。

3、画圈, 双氧水封闭：切片稍甩干后用免疫组化笔在组织周围画圈（防止试剂流走），切片平放于避光湿盒滴加3%双氧水溶液，室温避光孵育25 min左右，封闭内源性过氧化物酶。将玻片置于PH7.4 PBS中在钟摆摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

4、血清封闭：切片平放于透明湿盒滴加血清室温封闭30min。一抗是山羊来源用10%兔血清封闭，一抗其它来源的用3%BSA封闭。

5、加种一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加用无菌PBS按一定比例配好的种一抗，切片平放于透明湿盒内4°C孵育过夜（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）。

6、加对应种属HRP标记二抗：将玻片置于PH7.4 PBS中在钟摆摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后平放于透明湿盒在圈内滴加与一抗相应种属的HRP标记的二抗覆盖组织，室温孵育50min。

7、加iF555-TSA：将玻片置于PH7.4 PBS中在钟摆摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后将切片平放于避光湿盒在圈内滴加iF555-TSA，避光室温孵育10min。 孵育完后，将玻片置于TBST中在钟摆摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

8、微波处理：组织切片置于盛满PH 6.0 柠檬酸修复液的修复盒中于微波炉内加热处理维持沸腾10min左右去掉已经结合到组织上的一抗二抗，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。

9、血清封闭：切片平放于透明湿盒滴加血清室温封闭30min。一抗是山羊来源用10%兔血清封闭，一抗其它来源的用3%BSA封闭。

10、加第二种一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加用无菌PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于避光湿盒内4°C孵育过夜（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）。

11、对应的HRP标记的二抗：将玻片置于PH7.4 PBS中在钟摆摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后将切片平放于避光湿盒在圈内滴加与一抗相应种属的HRP标记的二抗覆盖组织，室温孵育50min。

12、加iF488-TSA：将玻片置于PH7.4 PBS中在钟摆摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后将切片平放于避光湿盒在圈内滴加iF488-TSA，避光室温孵育10min。 孵育完后，将玻片置于TBST中在钟摆摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

13、DAPI复染细胞核：切片稍甩干后将切片平放于避光湿盒在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10min。将玻片置于PH7.4 PBS中在钟摆摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

14、自发荧光淬灭：切片稍甩干后将切片平放于避光湿盒在圈内加入自发荧光淬灭剂5min，流水冲洗10min。

15、封片：将玻片置于PH7.4 PBS中在钟摆摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。

16、镜检成像：切片置于玻片数字扫描仪下扫描全景成像。