前沿简介：
趋化因子配体5（CCL5）是T细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞的趋化因子，在白细胞进入炎症位点过程中起着重要作用，在IL-2的帮助下。此外CCL5还是一种天然的HIV抑制因子。 

操作步骤：

实验开始前，各试剂均应平衡至室温（试剂不能直接在37℃溶解）；试 剂或样品稀释时，均需混匀，混匀时尽量避免起泡。实验前应预测样品含量，如样品浓度过高时，应对样品进行稀释，以使稀释后的样品符合试剂盒的检测范围，计算时再乘以相应的稀释倍数。
    1.标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10孔，在、第二孔中分别加标准品100μl，然后在、第二孔中加标准品稀释液50μl，混匀；然后从孔、第二孔中各取100μl分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl，混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉，再各取50μl分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取50μl分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第七、第八孔中分别取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第九第十孔中各取50μl弃掉。（稀释后各孔加样量都为50μl，浓度分别为180 ng/L，120 ng/L ，60 ng/L，30ng/L，15ng/L）。

2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品*终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。

4.配液：将30（48T的20倍）倍浓缩洗涤液用蒸馏水30（48T的20倍）倍稀释后备用。

5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

6.加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。

7.温育：操作同3。

8.洗涤：操作同5。

9.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟.

10.终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。

Elisa试剂盒酶标仪的使用过程中的一些问题：

1．阈值可疑范围的设定 一般酶标仪阈值矩阵设定可设定阴性、可疑、阳性3个范围。有经验表明可疑范围的设定要设定为临界上下15％（也称灰色区）为宜；同时阴性范围下限和阳性范围应该充分考虑到影响ELISA结果因素的存在，可疑范围上限必须考虑到双波长情况下出现负吸光度值和超范围报告影响结果的可能性。“灰色区"的结果的真实性是ELISA定性测定中*需要把握的环节，也是实验室引起医疗纠纷的主要方面，因此必须对可疑结果进行复检，用两种试剂盒。

上海伊丽萨生物科技有限公司   www.elisa123.com