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细胞培养问题
点击次数：865 发布时间：2013/10/10
1、如何选用培养基?
培养某一类型细胞没有固定的培养条件。在MEM中培养的细胞，很可能在DMEM或M199中同样很容易生长。总之，MEM做粘附细胞培养、RPMI-1640做悬浮细胞培养，各种目的无血清培养的是AIM V培养基（SFM）。在开始进行新的细胞培养时，可以参考下表所列的条件：
| 细胞系 | 细胞类型 | 种 | 组织 | 推荐使用的培养基 |
|---|---|---|---|---|
| 293 | 成纤维细胞 | 人 | 胚胎肾 | MEM，10% 热灭活马血清 |
| 3T6 | 成纤维细胞 | 小鼠 | 胚胎 | DMEM, 10% 胎牛血清 |
| A549 | 上皮细胞 | 人 | 肺癌 | F-12K, 10%胎牛血清 |
| A9 | 成纤维细胞 | 小鼠 | 结缔组织 | DMEM, 10% 胎牛血清 |
| AtT-20 | 上皮细胞 | 小鼠 | 垂体肿瘤 | F-10, 15% 马血清和2.5% 胎牛血清 |
| BALB/3T3 | 成纤维细胞 | 小鼠 | 胚胎 | DMEM, 10% 胎牛血清 |
| BHK-21 | 成纤维细胞 | 仓鼠 | 肾 | GMEM, 10% 胎牛血清 或MEM, 10% 胎牛血清 和NEAA |
| BHL-100 | 上皮细胞 | 人 | 乳房 | McCoy＇5A, 10% 胎牛血清 |
| BT | 成纤维细胞 | 牛 | 鼻甲骨细胞 | MEM, 10% 胎牛血清 和 NEAA |
| Caco-2 | 上皮细胞 | 人 | 结肠腺癌 | MEM, 20% 胎牛血清 和NEAA |
| Chang | 上皮细胞 | 人 | 肝脏 | BME, 10% 小牛血清 |
| CHO-K1 | 上皮细胞 | 仓鼠 | 卵巢 | F-12, 10% 胎牛血清 |
| Clone 9 | 上皮细胞 | 大鼠 | 肝脏 | F-12K, 10% 胎牛血清 |
| Clone M-3 | 上皮细胞 | 小鼠 | 黑素瘤 | F-10, 15% 马血清和 2.5% 胎牛血清 |
| COS-1 | 成纤维细胞 | 猴 | 肾 | DMEM, 10% 胎牛血清 |
| COS-3 | 成纤维细胞 | 猴 | 肾 | DMEM, 10% 胎牛血清 |
| COS-7 | 成纤维细胞 | 猴 | 肾 | DMEM, 10% 胎牛血清 |
| CRFK | 上皮细胞 | 猫 | 肾 | MEM, 10% 胎牛血清 和NEAA |
| CV-1 | 成纤维细胞 | 猴 | 肾 | MEM, 10% 胎牛血清 |
| D-17 | 上皮细胞 | 狗 | 骨肉瘤 | MEM, 10% 胎牛血清 和NEAA |
| Daudi | 成淋巴细胞 | 人 | 淋巴瘤病人血液 | RPMI-1640, 10% 胎牛血清 |
| GH1 | 上皮细胞 | 大鼠 | 垂体肿瘤 | F-10, 15% 马血清和 2.5% 胎牛血清 |
| GH3 | 上皮细胞 | 大鼠 | 垂体肿瘤 | F-10, 15% 马血清和 2.5% 胎牛血清 |
| H9 | 成淋巴细胞 | 人 | T细胞淋巴瘤 | RPMI-1640, 20% 胎牛血清 |
| HaK | 上皮细胞 | 仓鼠 | 肾 | BME, 10% 小牛血清 |
| HCT-15 | 上皮细胞 | 人 | 结肠直肠腺癌 | RPMI-1640, 10% 胎牛血清 |
| HeLa | 上皮细胞 | 人 | 子宫颈癌 | MEM, 10% 胎牛血清 和NEAA （in suspension, S-MEM） |
| HEp-2 | 上皮细胞 | 人 | 喉 癌 | MEM, 10% 胎牛血清 |
| HL-60 | 成淋巴细胞 | 人 | 早幼粒细胞白血病 | RPMI-1640, 20% 胎牛血清 |
| HT-1080 | 上皮细胞 | 人 | 纤维肉瘤 | MEM, 10% HI 胎牛血清 和NEAA |
| HT-29 | 上皮细胞 | 人 | 结肠腺癌 | McCoy＇s 5A, 10% 胎牛血清 |
| HUVEC | 内皮细胞 | 人 | 脐带 | F-12K, 10% 胎牛血清 和 肝素盐 100 ug/ ml |
| I-10 | 上皮细胞 | 小鼠 | 睾丸癌 | F-10, 15% 马血清和 2.5% 胎牛血清 |
| IM-9 | 成淋巴细胞 | 人 | 骨髓瘤病人骨髓 | RPMI-1640, 10% 胎牛血清 |
| JEG-2 | 上皮细胞 | 人 | 绒毛膜癌 | MEM, 10% 胎牛血清 |
| Jensen | 成纤维细胞 | 大鼠 | 肉瘤 | McCoy＇s 5A, 5% 胎牛血清 |
| Jurkat | 成淋巴细胞 | 人 | 淋巴瘤 | RPMI-1640, 10% 胎牛血清 |
| K-562 | 成淋巴细胞 | 人 | 骨髓性的白血病 | RPMI-1640, 10% 胎牛血清 |
| KB | 上皮细胞 | 人 | 口腔癌 | MEM, 10% 胎牛血清 和NEAA |
| KG-1 | 骨髓白细胞 | 人 | 红白血病病人骨髓 | IMDM, 20% 胎牛血清 |
| L2 | 上皮细胞 | 大鼠 | 肺 | F-12K, 10%胎牛血清 |
| L6 | 大鼠 | 骨骼肌成肌细胞 | DMEM, 10% 胎牛血清 | |
| LLC-WRC 256 | 上皮细胞 | 大鼠 | 癌 | Medium 199, 5% 马血清 |
| McCoy | 成纤维细胞 | 小鼠 | 未知 | MEM, 10% 胎牛血清 |
| MCF7 | 上皮细胞 | 人 | 乳腺癌 | MEM, 10% 胎牛血清 NEAA, 10ug/ml 胰岛素 |
| WEHI-3b | 类巨噬细胞 | 小鼠 | 骨髓单核细胞白血病 | DMEM, 10% 胎牛血清 |
| WI-38 | 上皮细胞 | 人 | 胚胎肺 | BME, 10% 胎牛血清 |
| WISH | 上皮细胞 | 人 | 羊膜 | BME, 10% 胎牛血清 |
| WS1 | 人 | 胚胎皮肤 | MEM, 10% 胎牛血清 和NEAA | |
| XC | 上皮细胞 | 大鼠 | 肉瘤 | MEM, 10% 胎牛血清 和NEAA |
| Y-1 | 上皮细胞 | 小鼠 | 肾上腺瘤 | F-10, 15% 马血清和 2.5% 胎牛血清 |
加热可以灭活补体系统。激活的补体参与溶解细胞事件，刺激平滑肌收缩，细胞和血小板释放组胺，激活淋巴细胞和巨噬细胞。在进行免疫学研究、培养ES细胞、昆虫细胞和平滑肌细胞时，推荐使用热灭活血清。
3、L-谷氨酰胺在细胞培养中重要吗?它在溶液中不稳定吗?
L-谷氨酰胺在细胞培养时是重要的。脱掉氨基后，L-谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。L-谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降解，但是确切的降解率一直没有*终确定。L-谷氨酰胺的降解导致氨的形成，而氨对于一些细胞具有毒性。
4、GlutaMAX-I是什么?培养细胞如何利用GlutaMAX-I?这个二肽有多稳定?
GlutaMAX-I二肽是L-谷氨酰胺的衍生物，将其不稳定的α-氨基用L-丙氨酸来保护。一种肽酶逐渐裂解二肽，释放L-谷氨酰胺供利用。
GlutaMAX-I二肽非常稳定，即使在121磅灭菌20分钟，GlutaMAX-I二肽溶液有*小的降解，如果在相同条件下，L-谷氨酰胺几乎完全降解。
5、为什么培养基中可以省去加酚红?
酚红在培养基中被用来作为PH值的指示剂：中性时为红色，酸性时为黄色，碱性时为紫色。研究表明，酚红可以模拟固醇类激素的作用（特别是雌激素）。为避免固醇类反应，培养细胞，尤其是哺乳类细胞时，用不加酚红的培养基。由于酚红干扰检测，一些研究人员在做流式细胞检测时，不使用加有酚红的培养基。
6、如何用台盼兰计数活细胞?
用无血清培养基把细胞悬液稀释到200-2000个/毫升，在0.1毫升的细胞中加入0.1毫升的0.4%的台盼兰溶液。轻轻混匀，数分钟后，用血球计数板计数细胞。活细胞排斥台盼兰，因而染成蓝色的细胞是死细胞。
7、如何消除组织培养的污染?
当重要的培养污染时，研究者可能试图消除或控制污染。首先，确定污染物是细菌、真菌、支原体或酵母，把污染细胞与其它细胞系隔离开，用实验室消毒剂消毒培养器皿和超净台，检查HEPA过滤器。
高浓度的抗生素和抗霉菌素可能对一些细胞系有毒性，因而，做剂量反应实验确定抗生素和抗霉菌素产生毒性的剂量水平。这点在使用抗生素如两性霉素B和抗霉菌素如泰乐菌素时尤其重要。下面是推荐的确定毒性水平和消除培养污染的实验步骤。
① 在无抗生素的培养基中消化、计数和稀释细胞，稀释到常规细胞传代的浓度。
② 分散细胞悬液到多孔培养板中，或几个小培养瓶中。在一个浓度梯度范围内，把选择抗生素加入到每一个孔中。例如，两性霉素B推荐下列浓度，0.25，0.50，1.0，2.0，4.0,8.0 mg/ml。
③ 每天观测细胞毒性指标，如脱落，出现空泡，汇合度下降和变圆。
④ 确定抗生素毒性水平后，使用低于毒性浓度2-3倍浓度的抗生素的培养液培养细胞2-3代。
⑤ 在无抗生素的培养基中培养细胞一代。
⑥ 重复步骤4。
⑦ 在无抗生素的培养基中培养4-6代，确定污染是否以已被消除。
8、培养基中丙酮酸钠的作用是什么?
丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源。尽管细胞更倾向于以葡萄糖作为碳源，但是，如果没有葡萄糖的话，细胞也可以代谢丙酮酸钠。
9、为什么储存在冰箱中的胎牛血清会出现沉淀?
GIBICO的胎牛血清 没有预老化，储存在2-8℃时，血清中的各种蛋白和脂蛋白（如冷凝集素、纤维蛋白原、玻粘连蛋白等）可能聚集而形成沉淀或可见的混浊。这应该不会影响血清的质量。推荐在-20℃储存胎牛血清，避免反复冻融。
10、目录上说，Hank’s 平衡盐溶液（HBS）要在空气中使用，不需要CO2培养箱。原因是什么?
Hank’s 平衡盐溶液（HBS）和Earle’s平衡盐溶液（EBS）有什么本质的功能差别?
HBS和 EBS 的主要差别在于碳酸氢钠的水平，碳酸氢钠的含量在Eagles （2.2g/L）中比在Hanks （0.35g/L） 中高。碳酸氢钠需用高水平的CO2平衡，以维持溶液的PH值。Eagles液在空气水平的CO2 中，溶液会变碱，Hanks液在CO2 培养箱中会变酸。如果希望在CO2培养箱中保存组织，需要用Eagles液。如果仅仅是清洗将要在细胞培养基中储存的组织，用Hanks液就可以了。
11、Qualified和 Certified 胎牛血清有什么差别?
Certified 胎牛血清包括了Qualified 胎牛血清执行的所有的标准检验程序，而且除了这些标准检测，Certified胎牛血清还有如下一些附加的检测：
End-Point Determination of Endotoxin Content
噬菌体检验
生物化学检测
激素的检测
血红蛋白检测
Sf9 细胞生长促进及方法学检测
12、二价离子抑制胰蛋白酶活性吗?使用胰蛋白酶时加入EDTA的目的是什么?
二价离子的确抑制胰蛋白酶活性。EDTA用来螯合游离的镁离子和钙离子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建议胰蛋白酶处理细胞前，用EDTA清洗细胞，以消除来自培养基中所有的二价离子。
13、制备 lipid-DNA的方法会影响转染效率吗?
是的。对于LIPOFECTAMlNE Reagent，稀释试剂在100μl OPTI-MEM中，稀释DNA在100μl OPTI-MEM中。混合两种溶液在室温下孵育15分钟。对于LIPOFECTIN Reagent，在加入DNA溶液前允许稀释的试剂和培养基孵育至少30分钟可以增加3倍的效率。确保复合物在没有血清的情况下形成。孵育15分钟后，在复合物中加入含有血清的培养基（800μl）。（注意以上是35mm培养皿使用体积）。对于LIPOFECTAMlNE Plus Reagent DNA应该在与脂质体混合之前首先与Plus Reagent混合。LIPOFECTAMlNE 2000的操作步骤允许在一个很小的体积下混合DNA和脂质体，接下来可以不需要换培养基的情况下直接加入。对于每一种脂质体的详细的信息可以参考产品说明书。
14、我使用SF900 Ⅱ时，细胞生长良好，但是为什么我的蛋白产物不如使用Graces 液和10%胎牛血清时效果好?
如果目的蛋白是一个后期蛋白，它将与蛋白酶一起表达，这些蛋白酶将会作用于目的蛋白。在加有血清的培养基中，这些蛋白酶将作用到血清中的蛋白，从而使目的蛋白产品保持完好。在无血清配方中，蛋白酶作用的底物是你的目的蛋白。为了避免这一问题，加入一些蛋白酶抑制剂或加入少量的血清（少于1%），让血清给蛋白酶提供作用底物。
15、如何检测内毒素（热源）水平?
LAL（Limulus Amebocyte Lysate）试验是可用的*敏感和特异的检测细菌内毒素的方法。Levin和Bang 发现细菌可引起鲎（Limulus polyphemus）血管内的凝集作用。内毒素启动一个细胞内酶原系统（丝氨酸蛋白酶级联反应系统），通过修饰凝集素，产生一种透明的胶，LAL中的凝固蛋白，从而，形成不可溶的基质。LAL试剂缓冲的鲎（血细胞）裂解物。
胎牛血清的内毒素检测是在Grand Island，按照手册上Gel-clot 方法进行的。在对血清产品进行内毒素检测前，用无热源的水1：10稀释样品。稀释样品沸水育5分钟，以消除抑制剂。（通常，血液中的内毒素结合成份的出现会抑制凝胶过程，使内毒素不能与LAL反应。样品预先热处理可以消除这种抑制作用。）
16、我可以使用固体形式的Murashige Skog 培养基吗?
如果使用固体形式的培养基，需要加入琼脂。琼脂加入前要先灭菌。应该避免MS培养基的直接灭菌，应该高压灭菌琼脂溶液，然后把融化的琼脂溶液加入到MS培养基中。
17、20℃下配制的缓冲液，在较高或较低的温度下PH值会改变吗?
对于普通使用的缓冲液，PH值随温度变化而变化。下表列出温度改变10℃时，PH值的变化情况。
例如 20℃下配制PH7.4 Tris缓冲液，40℃时PH值为 7.4-（2x0.310）=6.78
| 缓冲系统 | pKa/20℃ | [Delta]pKa/10℃ |
|---|---|---|
| Mes | 6.15 | -0.110 |
| Ada | 6.60 | -0.110 |
| Pipes | 6.80 | -0.085 |
| Aces | 6.90 | -0.200 |
| Bes | 7.15 | -0.160 |
| Mops | 7.20 | -0.013 |
| Tes | 7.50 | -0.200 |
| Hepes | 7.55 | -0.140 |
| Tricine | 8.15 | -0.210 |
| Tris | 8.30 | -0.310 |
| Bicine | 8.35 | -0.180 |
| Glycylglycine | 8.40 | -0.280 |
缓冲液的PH值随温度变化而变化。下表列出了50mM Tris-HC 溶液在4℃，25℃，37℃时，不同的PH值。
| 4℃ | 25℃ | 37℃ |
|---|---|---|
| 8.1 | 7.5 | 7.2 |
| 8.2 | 7.6 | 7.3 |
| 8.3 | 7.7 | 7.4 |
| 8.4 | 7.8 | 7.5 |
| 8.5 | 7.9 | 7.6 |
| 8.6 | 8.0 | 7.7 |
| 8.7 | 8.1 | 7.8 |
| 8.8 | 8.2 | 7.9 |
| 8.9 | 8.3 | 8.0 |
| 9.0 | 8.4 | 8.1 |
| 9.1 | 8.5 | 8.2 |
| 9.2 | 8.6 | 8.3 |
| 9.3 | 8.7 | 8.4 |
| 9.4 | 8.8 | 8.5 |
生长培养基的PH值对细胞的增值和病毒或重组蛋白的生产均会产生影响。对于大部分鳞翅类昆虫细胞系，在PH值 6.0-6.4范围的大部分应用效果良好。培养鳞翅类昆虫细胞系时，培养基的*适渗透压是 345-380mOsm/kg.。为保证可靠和持久的细胞培养方式，减少技术问题，保持PH值和渗透压在以上所列的范围之内。
20、High Five细胞有任何其它名称吗?
High Five细胞也被称为Trichoplasia ni 5B1-4和BTI-TN-5B1-4。
21、PFHM-II 和HYBRIDOMA-SFM之间有什么差别?
PFHM-II （Protein-free Hybridoma Medium）是不包含有蛋白质的单克隆抗体生产培养基。如果作为杂交瘤生产培养基使用，PFHM-II可能需要补充低水平的血清。HYBRIDOMA-SFM即是杂交瘤生产培养基，也是单克隆抗体生产培养基。它包含低水平的蛋白质。
22、在High Five无血清培养基中去污剂的浓度是多少?
High Five无血清培养基中去污剂的浓度：0.025 g/L Tween-80，1.0 g/L Pluronic Poly-all。
23、High Five细胞用多大的密度冻存?
3.0x106 cells/ml
24、在我的果蝇培养基中发现形成白色沉淀，加热后溶解。它是什么?对我的细胞有害吗?
可能是谷氨酰胺沉淀，但是更可能是L-酪氨酸沉淀。培养基中谷氨酰胺的浓度比典型的2mM高6倍。酪氨酸的浓度比在RPMI 1640中高25倍，而且比谷氨酰胺更加难以溶解。沉淀也可能是不止一种成分的复合物。它可能是由于贮存在局部温度较低的地方引起。只要沉淀在培养条件下可以溶解，对实验不会有不利的影响。
25、如何从T25瓶中转移sf9细胞?能用胰蛋白酶消化吗?
我们强力推荐使用脱落细胞的方法，因为这项技术破坏性*小，生活力。正如手册上所显示，通过使用巴氏德吸液管，让细胞上培养基流动。作为一种选择你也可以轻轻拍打培养瓶。只有在绝对必要的情况下，才使用胰酶消化细胞。
胰酶消化一个T25瓶的sf9细胞：
① 去除培养基。
② 用2ml 1xPBS（足以覆盖细胞表面）洗涤细胞，去除PBS。
③ 加入2ml 1x胰酶EDTA（恰好覆盖细胞表面）。
④ 37 ℃孵育5到10分钟。在仪器下检测看到5分钟后它们正在向上移动。
⑤ 向细胞中加入2ml 细胞培养液，移入锥形管，用2ml培养液洗瓶壁，移入同一锥形管中。（培养基中的FBS终止了胰酶的活性。）
⑥ 离心（1100rpm）沉淀细胞。去除培养基。
⑦ 用新的培养基重新悬浮细胞。传代。
26、在Sf9, Sf21, 和high Five细胞悬浮培养时，肝素的使用量是多少?
为了防止悬浮培养细胞聚集的形成，使用肝素浓度为10单位/毫升细胞悬液。
27、如何评估ES细胞合格的胎牛血清?
使用D3 ES细胞。这是一个对于胎牛血清中生长促进、生长抑制和分化因子非常敏感的细胞系。
相关生长效率分析：
当ES细胞以非常低的密度传入包含10%胎牛血清的生长培养基中，检测开始和支持ES细胞克隆的能力。
细胞毒分析：
当以非常低的密度传入包含30%胎牛血清的生长培养基中，检测ES细胞和feeder细胞的生长能力。
相关形态学和分化分析：
检测胎牛血清支持未分化ES细胞克隆的能力。通过碱性磷酸酶活性评估分化程度。未分化的ES细胞小颜色深红粉红，分化的细胞较大，丰满，颜色较浅。
所有的分析在没有ESGRO的情况下进行的，培养基中出现ESGRO会掩盖由胎牛血清所导致的问题。（ESGRO或LIF经常用来保持ES细胞处于未分化状态。）
经过培养发现，大约8批中有1批可以用来培养ES细胞。
28、在重新冻存sf9细胞前，它可以传多少代?随着传代的次数的增加，它的感染能力会降低吗?
通常情况当细胞经过30次传代后，应该返回冻存。无论什么时候记数时，都应该检查细胞活力。如果超过95%的细胞保持有活力和在大约30小时左右加倍，细胞仍然可以使用。如果活力和加倍时间下降，它们的感染力将不在是有效的。
