一、原理：

 

用酸处理过的活性炭把还原型的抗坏血酸氧化为脱氢型抗坏血酸再继续氧化为二酮古乐糖酸。二酮古乐糖酸与2.4-二硝基苯肼偶联生成红色的络合物。其呈色的强度与二酮古乐糖酸浓度成正比，可以比色定量。

二、试剂：

（1） 1％草酸溶液。

（2） 2％草酸溶液。

（3）

酸处理过的活性炭：取200克活性炭，加入10％盐酸1000ml，煮沸后，抽气过滤，再用沸水1000ml煮沸，过滤，重复用水洗至滤液中无高价铁离子（即用1％硫溶液试验不呈红色为止），于100-120℃烘干。

（4）

2％2.4-二硝基苯肼溶液：取2克2.4-二硝基苯肼溶液溶解于lOOml9N硫酸中。

（5）

9N硫酸溶液：量取浓硫酸250ml，慢慢地倒入750m1水中，加水边搅拌。

（6）

10％硫酸溶液：称取5克硫酸，溶解于50ml50％酒精中。

（7）

85％硫酸溶液：精确称取20mg抗坏血酸，溶解在1％草酸中，溶液稀释至lOOml。吸取此液50ml，加入0.1克活性炭，振摇1分钟，过滤吸取上述滤液5ml，用1％草酸稀释到100毫升（此标准使用液每亳升含lOug抗坏血酸）。

三、操作方法：

（1）样品的处理和分析：称取适量样品加等量的2％草酸溶液于组织捣碎机中打成匀浆。取匀浆20克用1％草酸稀释至lOOml，摇匀，过滤。

取滤液lOml，加入1％草酸10ml（取滤液的量视抗坏血酸含量而定，一般控制每毫升抗坏血酸的浓度为1-lOug），加l勺活性炭，摇1分钟，静置过滤。

各取滤液2毫升于样品管和样品空白管中，各管加1滴硫酸溶液。于样品管中加入2.4-二硝基苯肼0.5ml，样品管，样品空白管加盖，置于37℃保温箱中保温3小时。后取出样品管放人冰水中，样品管和样品空白管置于冰浴中，从滴点管中滴加85％硫酸2ml于各管中，边滴边摇试管（为防止溶液温度升高，溶液中糖炭化而转黑色）。

将各管于冰浴中取出，在室温下放置30分钟后，立即在分光光度计波长540nm处读取光密度。根据测得的光密度，从标准曲线中查出相应的含量。

（2）

标准曲线的绘制：分别吸取抗坏血酸标准工作液10、20、30、40、50ml，稀释至50ml，这些标准液每毫升含有2、4、6、8、lOug抗坏血酸。   

各取2ml，置于各标准管中，加硫酸溶液1滴和2．4-二硝基苯肼溶液0.5ml，置各管于30℃保温箱中保温3—4小时，取出，放在冰浴中，于各管中滴加85％硫酸2.5ml边滴边摇试管，然后取出，放置30分钟，于分光光度计540nm波长条件下测定光密度。根据测得的光密度绘制标准曲线。

同时作一试剂空白，于一试剂空白管中加入1％草酸溶液2m1，操作同标准管。

计算：每百克食品中含抗坏血酸的毫克数＝C/W×100

C：相当于标准溶液的量（mg）

W：测定时所取得样品溶液相当于样品的量（g）

四、说明：

（1）    加入85％硫酸后，将试管从水中取出。溶液的颜色会继续变深所以必须计算好，加入硫酸后准于30分钟内比色。

（2）硫酸可防止抗坏血酸被氧化，且可帮助准于的形成，*终溶液中硫酸的浓度均需一致，否则影响色度。