超氧化物岐化酶(SOD)的应用方案(三氮蓝四唑NBT法测定)

引言：

SOD是含金属辅基的酶。高等植物含有两种类型的SOD:Mn-SOD和Cu.Zn-SOD，它们都催化下列反应:由于超氧自由基(02)为不稳定自由基，寿命短，测定SOD活性一般为间接方法。并利用各种呈色反应来测定SOD的活力。核黄素在有氧条件下能产生超氧自由基负离子02-..-，当加入NBT后，在光照条件下，与超氧自由基反应生成单甲躜(黄色)，继而还原生成二甲躜，它是一种蓝色物质，在560nm波长下有da吸收。当加入SOD时，可以使超氧自由基与H结合生成H2O2和02，从而抑制了NBT光还原的进行，使蓝色二甲攒生成速度减慢。通过在反应液中加入不同量的SOD酶液，光照－－定时间后测定560nm波长下各液光密度值，抑制NBT光还原相对百分率与酶活性在一定范围内呈正比。反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低。

仪器及试剂

美析UL-1000超微量紫外可见分光光度计

离心机

0.05mol/L 磷酸缓冲液(PBS，pH7.8):

A母液: 0.2mol/L磷酸氢二钠溶液:取Na2HPO4 12H20(分子量358.14)71.7g; B 母液: 0.2mol/L 磷酸二氢钠溶液:取NaH2PO4 12H2O (分子量156.01) 31.2g。分 别用蒸馏水定容到1000ml。

0.05mol/L PBS ( pH7.8)的配制:分别取A母液(Na2HPO4) 228.75ml,

B母液(NaH2PO4) 21.25ml，用蒸馏水定容至1000ml。

14.5mM甲硫氨酸溶液:称取1.0818g Met用磷酸缓冲液(pH7.8)定容至500ml。

3mM EDTA-Na2溶液:称取0.1117g EDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至100ml。

60μM核黄素溶液:称取0.0023g核黄素用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存。

2.25mM氮蓝四唑(NBT)溶液:称取0.092g NBT用PBS定容至50ml,避光保存。

实验步骤

1.酶液提取

称取0.5g (可视情况调整)样品(新鲜叶片或根系)洗净后置于预冷的研钵中，分三次加入10ml 50mmol/L预冷的磷酸缓冲液(pH7.8) 在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4C、12000g 下离心20min，.上清液即为SOD粗提液。

2.酶活性测定

(1)反应混合液配制(以60个样为准):分别取配好的Met溶液162ml,.EDTA-Na2溶液6ml，NBT 溶液6ml，核黄素溶液6ml,混合后充分摇匀;

(2)分别取2.9ml反应混合液和0.1ml (可视情况调整)酶液于指形管中此即反应管;同时做两支对照管，其中1支试管加2.9ml反应混合液和0.1ml PBS (不加酶液)作为da光还原管，另1支加2.9ml反应混合液和0.1mlPBS同时用锡箔纸包好遮光用于测定时调零。

(3)将试管置于光照培养箱中在4000lux光照25°C下反应20min;

(4)反应结束后以不照光的对照管调零，分别测定各管在560nm下的吸光度(OD560 )

计算结果

已知SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50%为一-个酶活单位(U),

按下式计算活性n=[(ODmax 0D560)/0Dmax]/2

SOD总活性= [( Ack-AE)XV]/ (1/2AckXWXVt)

SOD比活力=SOD总活性/蛋白质含量

SOD总活性以鲜重酶单位每克表示(u/gFW);比活力单位以酶单位每:毫克蛋白表示;

 Ack 为照光对照管的吸光度;

AE 为样品管的吸光度;

 V为样品液总体积(ml);

Vt 为测定时的酶液用量(ml); W为样品鲜重(g);

蛋白质含量单位为mg/g。

注意事项

1.酶液提取须在4℃下进行，提取后立即进行测定，冰箱中放几小时活性也会下降;

2.植物中的酚类物质对测定有干扰，制备粗酶液时可加入聚乙烯吡咯烷酮(PVP)或pvpp等，尽可能除去植物组织中的酚类等次生物质。

3.NBT反应液配好后过滤除去不溶物立即使用，若置于冰箱中要避光保存，充分摇匀然后使用。

4.加反应液时hao在暗光下进行;

5.核黄素产生02，NBT还原为蓝甲躜都与光照密切相关，照光强度和时间要严格控制。光照培养箱内壁裱糊锡箔纸，使箱内均匀光照约达40μ molms，同时使照光时间一一样，选择试管尽量- -致，照光结束后测-一个拿一个(hao晚.上做) (温度高时照光时间缩短，温度低时延长);

6.测定活性时加入的酶量，以能抑制反应的50%为佳。(一个酶单位相当于引起反应液达到半抑制时酶的用量,即以能抑制反应50%的酶量为一个SOD酶活性单位。)(反应液中加酶液与PBS调零差异不大，反应液调零与其它两个则有一定差异。)

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