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技术文章
还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）试剂盒资料
产品说明书（中文版）
试剂盒用途
还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）活性比色法定量检测试剂是一种旨在通过乳酸脱氢酶反应系统测定细胞或组织样品中的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的含量，即采用比色法测定其氧化后峰值的变化，进行浓度测算的权威而经典的技术方法。该技术由大师级科学家精心研制、成功实验证明的。其适用于各种细胞或组织裂解悬液样品（动物、人体、植物、昆虫等）还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的活性检测。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。
技术背景
还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）是糖酵解通路中通过转化为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD）而产生乙醇所必须的辅助因子，是细胞生理学中能量代谢、脂肪酸代谢和糖代谢的重要因子。通常乳酸脱氢酶反应系统被用于测定NADH（340nm 波长）的浓度，其反应方式为：
丙酮酸+ NADH← 乳酸 脱氢酶→乳酸+ NADH+
（高吸收峰）（低吸收峰）
产品内容
缓冲液（Reagent A）毫升
反应液（Reagent B）毫升
酶促液（Reagent C）微升
阴性液（Reagent D）毫升
产品说明书1 份
保存方式
保存 反应液（Reagent B）和 酶促液（Reagent C）在－20℃冰箱里；其余的保存在 4℃
冰箱里； 反应液（Reagent B）避免光照；有效保证 6 月
用户自备
1.5 毫升离心管：用于反应液配制的容器比色皿：用于比色的容器分光光度仪：用于比色分析
酶标仪：用于微量样品比色分析
实验步骤
实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的 反应液（Reagent B）和 酶促液（Reagent C）
置入冰槽里融化； 反应液（Reagent B）避免光照。然后进行下列操作。
一、 测定准备
1． 准备好待测 NADH 的样品（例如细胞或组织裂解悬液样品等），置于冰槽里
2． 设定好分光光度仪（温度为 25℃）：波长 340nm，设置 0 分钟和 5 分钟各测读 1 次，并置零
| 二、 背景对照测定 |
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| 1． 移取 | 微升 缓冲液（Reagent | A）到新的比色皿 |
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| 2． 加入 | 微升 反应液（Reagent | B） |
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| 3． 加入 | 微升 酶促液（Reagent | C） |
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| 4． 置于 25℃温度下孵育 5 分钟，避免光照 |
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| 5． 放进分光光度仪，置零 |
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| 6． 取出比色皿 |
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| 7． 加入 | 微升 阴性液（Reagent | D） |
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| 8． 上下倾倒数次，混匀（限定在 3 秒之内） |
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| 9． 即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照（0 分钟读数－5 分钟读数） |
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| 三、 样品测定 |
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| 1． 移取 | 微升 缓冲液（Reagent | A）到新的比色皿 |
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| 2． 加入 | 微升 反应液（Reagent | B） |
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| 3． 加入 | 微升 酶促液（Reagent | C） |
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| 4． 置于 25℃温度下孵育 5 分钟，避免光照 |
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| 5． 放进分光光度仪，置零 |
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| 6． 取出比色皿 |
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| 7． 加入 100 微升（20 微克总蛋白）待测样品（注意：样品须清澈） |
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| 8． 上下倾倒数次，混匀（限定在 3 秒之内） |
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| 9． 即刻放进分光光度仪检测，此为样品读数（0 分钟读数－5 分钟读数） |
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| 10．（选择步骤）重复实验步骤 1 至 9，测读新的样品 |
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| 四、计算样品浓度 |
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| （样品读数 − 背景对照读数 ）× 样品稀释倍数 |
| = | 物质的量浓度 • μmol ⋅ ml−1 | = 样品浓度 • μmol ⋅ mg | −1 | |
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| 0.1ml（样品容量 ） × 6.22（毫摩尔吸光系数 ） |
| 质量浓度浓度 • mg ⋅ ml-1 |
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| 五、酶标板测定 |
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| 1． 在 96 孔酶标板上做好相应标记：背景对照和待测样品 |
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| 2． 分别移取 | 微升 缓冲液（Reagent | A）到相应孔中 |
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| 3． 分别加入 | 微升 反应液（Reagent | B） |
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| 4． 分别加入 | 微升 酶促液（Reagent | C） |
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5． 轻轻摇动酶标板，混匀
| 6． 置于 25℃温度下孵育 5 分钟，避免光照 |
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| 7． 分别加入 | 微升 阴性液（Reagent | D）和待测样品（10 微克总蛋白） |
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| 8． 轻轻摇动酶标板，混匀 |
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| 9． 即刻放进酶标仪检测：0 分钟读数和 5 分钟读数 |
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| 10．浓度计算： |
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| （样品读数 − 背景对照读数 ）× 样品稀释倍数 | = | 物质的量浓度 • μmol ⋅ ml−1 | = 样品浓度 • μmol ⋅ mg | −1 | |
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| 0.025ml （样品容量 ） × 6.22（毫摩尔吸光系数 ）× 0.5 | 质量浓度浓度 • mg ⋅ ml-1 |
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注意事项
1． 本产品为 21 次（比色皿）和 80 次（酶标板）操作，包括背景对照
2． 操作时，须戴手套
3． 系统操作过程中，背景测定只需 1 次
4． 样品须澄清，至关重要
5． 孵育时，避免光照
6． 加样后即刻比色测定
7． 反应 1 分钟后比色测定值趋于稳定；测定值由高到低变化；测定持续 5 分钟（终点测定）
8． 比色测定后，比色皿须清洗彻底
9． 建议待测样本的 OD340 为 0.2 至 0.8 为理想状态
10．如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度
11．本公司提供系列细胞生化检测试剂产品
质量标准
1． 本产品经鉴定性能稳定
2． 本产品经鉴定检测敏感
原创作者：齐一生物科技（上海）有限公司
