活体细胞线粒体内膜功能/膜电位红色荧光（TMRM）测定试剂是一种旨在通过四甲基罗丹明甲酯染料，选择性地聚集在线粒体内呈现荧光染色，其荧光的增强或减弱说明线粒体膜电位的变化，即内膜电负性的增高或降低，来分析线粒体内膜功能的完整性的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种线粒体制备物的功能检测。可以被用于细胞凋亡、信号传递、衰老等的研究。产品严格无菌，即到即用，活体检测，操作简易，性能稳定。

技术背景

四甲基罗丹明甲酯（tetramethylrhodamine methyl ester；TMRM），为罗丹明衍生物阳离子染料，作为电势测定（potentiometric）荧光探针：，具有亲脂性，且细胞低毒和光稳定； 第二，与线粒体内膜负电极结合而聚集；第三，容易进入细胞及其线粒体。四甲基罗丹明甲酯进入细胞后，被细胞内酯酶切离，产生四甲基罗丹明。四甲基罗丹明进入线粒体后，被线粒体俘获，分布和结合在线粒体内膜上，呈现强烈荧光。线粒体膜电位的高低变化决定了TMRM的分布浓度。电位高，TMRM在线粒体的浓度高，显示为强力红色或桔红色；反之，TMRM弥散在胞浆内，荧光减弱表明线粒体膜电位受到损害。 

产品内容

染色液（Reagent A）   100微升

稀释液（Reagent B）    10毫升

清理液（Reagent C）    50毫升

强化液（Reagent D）1毫升

产品说明书1份

保存方式

保存清理液（Reagent C）在4℃冰箱里，其余的保存在－20℃冰箱里；染色液（Reagent A）避免光照；有效保证6月

用户自备

胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（GMS12024）：用于细胞脱离

完全细胞培养液（GMS12052）：用于细胞脱落收集

1.5毫升离心管：用于活体细胞线粒体染色的容器

微型台式离心机：用于细胞收集的操作

培养箱：用于染色孵育

（共聚焦）荧光显微镜：用于活体细胞线粒体荧光定性分析

比色皿或96孔板：用于荧光定量分析的容器

荧光分光光度仪或荧光酶标仪：用于活体细胞线粒体荧光定量分析

细胞流式仪：用于活体细胞线粒体荧光分析

实验步骤

实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的染色液（Reagent A）置入冰槽里融化，稀释液（Reagent B）放进37℃恒温水槽里预热。然后移出10微升染色液（Reagent A）到新的1.5毫升离心管，加入890微升稀释液（Reagent B），混匀后，在冰槽里静置，并标记为染色工作液，放在暗室里。然后进行下列操作。

一、直接法

1． 准备1个24孔细胞培养板的待测细胞，每孔铺满率达70％（约10⁵细胞数）

2． 小心抽去细胞培养液

3． 轻轻沿着孔壁加入1毫升 清理液（Reagent C）到细胞培养孔，覆盖培养孔表面

4． （选择步骤）加入50微升强化液（Reagent D），轻轻混匀

5． （选择步骤）冰上孵育5分钟

6． 小心抽去1毫升 清理液（Reagent C）

7． 加入450微升含有染色液（Reagent A） 和稀释液（Reagent B）的染色工作液，覆盖培养孔表面

8． 放进37℃细胞培养箱里，孵育20分钟（注意避光）

9． 小心抽去450微升染色工作液

10． 小心加入500微升清理液（Reagent C）（注意：检测前置于冰槽里）

11． 即刻在倒置荧光显微镜下进行观察（滤波器激发波长540nm，散发波长580nm ）――可见

亮橘红色荧光；如果强度显著减弱，表明线粒体膜电位受到破坏

二、间接法

1． 准备1个12孔细胞培养板的待测细胞，每孔铺满率达70％（约30万细胞数）

2． 小心移出细胞培养液到15毫升锥形离心管（收集悬浮细胞）

3． 加入1毫升 清理液（Reagent C）到细胞培养孔，覆盖培养孔表面

4． 小心移出1毫升 清理液（Reagent C）到15毫升锥形离心管（收集洗脱细胞）

5． 加入500微升用户自备的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，铺满整个培养孔表面

6． 置入37℃培养箱1分种

7． 轻轻抖动培养板，使细胞脱落，然后加入1毫升完全细胞培养液

8． 移入15毫升锥形离心管

9． 放进 台式离心机离心5分钟，速度为300g

10． 小心抽去上清液

11． 加入50微升清理液（Reagent C）

12． 用200微升枪头上下轻柔抽吸，混匀细胞颗粒群

13． 转入到1.5毫升离心管或细胞流式仪专用测试管

14． 加入450微升含有染色液（Reagent A） 和稀释液（Reagent B）的染色工作液

15． 轻度涡旋震荡2秒

16． 放进37℃细胞培养箱里，孵育20分钟（注意避光）

17． 放进 台式微型离心机离心5分钟，速度为300g

18． 小心抽去上清液

19． 加入500微升清理液（Reagent C）（注意：检测前置于冰槽里）

选择一、（共聚焦）荧光显微镜观察 

1． 混匀后，移出50微升在载玻片上

2． 即刻进行载玻片压片，在荧光显微镜下进行观察（滤波器激发波长540nm，散发波长580nm） ――可见亮橘红色荧光；如果强度显著减弱，表明线粒体膜电位受到破坏

选择二、细胞流式仪分析

1. 混匀后，即刻进行细胞流式仪分析：观察50000个细胞以上

选择三、荧光分光光度仪或荧光酶标仪测定

1． 混匀后，移出100微升到黑色96孔板里或100微升比色皿里

2． 即刻进行荧光分光光度仪或荧光酶标仪测定（激发波长540nm，散发波长580nm），获得相对荧光单位（RFU）：RFU值高表明线粒体膜电位正常

注意事项

1． 本产品为20次（0.5毫升工作液）操作

2． 操作时，须戴手套

3． 待测细胞建议不要过于饥饿或过度生长

4． 建议细胞染色完成后，即刻进行荧光检测分析

5． 孵育时，避免光照

6． 健康细胞和线粒体呈现橘红色；死亡或凋亡细胞及损伤线粒体呈现黯淡或无荧光

7． 本公司提供FCCP溶液，作为线粒体膜电位破坏分子，观察荧光显著减弱现象

8． 参考图像

1） 荧光显微镜：左侧为正常样品；右侧为处理样品

2）细胞流式仪：上图为正常样品；下图为FCCP处理样品

9． 本公司提供系列线粒体试剂产品

质量标准

1． 本产品经鉴定性能稳定

2． 本产品经鉴定荧光清晰