Percoll不连续密度梯度沉淀法分离纯化淋巴细胞和淋巴母细胞

一　原理

　　Percoll是一种包有乙烯吡咯烷酮的硅胶颗粒。渗透压很低<20mosm／kg H２O, 粘度也很小，可形成高达1.3g／ml密度，采用预先形成的密度梯度时可在低离心力200～1000g于数分至数十分钟内达到满意的细胞分离结果。由于Percoll扩散常数低，所形成的梯度十分稳定。此外，Percoll不穿透生物膜，对细胞无毒害，因此广泛用于分离细胞、亚细胞成分、细菌及病毒，还可将受损细胞及其碎片与完好的活细胞分离。

　　二操作方法及注意事项

　　1.不同浓度密度Percoll溶液的制备: 先用9份Percoll与1份8.5％ NaCl或1.5MPBS混合达到生理性渗透压，然后用生理溶液0.85％ NaCl或0.15M PBS稀释到所需浓度。

　Percoll浓度％　　70　　　　60　　　　50　　　　40　　　　30　　　　　20

　　比重g／ml　　 　1.090     1.077     1.067     1.056     1.043       1.031

   2.　不连续密度梯度Percoll层的制备: 先将试管壁用牛血清湿润，除去多余血清，这种预处理可使逐层叠加的Percoll液平稳沿管壁流下，使形成满意的界面。在制备过程中一般用长针头注射器从高密度向低密度逐层放置，有时相邻两层Percoll比重相差不大时，可将Percoll液放入注射器中，小针头斜面紧贴管壁，任其自然慢慢流下。

　　3.　装样：样品体积和细胞浓度根据不同细胞而异，一般加样体积不宜过大，细胞浓度也不可过高，否则会影响细胞的分离和回收。

　　4.　离心：一般采用离心力为400g，时间20～25min。由于多层Percoll之间密度差别不大，因此离心机加速、降速时要慢，要平稳。

　　5.　取样：当所要分离的细胞绝大部分在两层的界面时，可逐层去除Percoll液后收集界面部位的细胞;有时大部分细胞位于Percoll层中,则需要逐层收集。收获含有Percoll液的细胞经2次洗涤后可供培养或检测用。

　　三分离纯化细胞举例

　　1.　富含NK活性大颗粒淋巴细胞LGL的纯化:按顺序由下向上逐层加50％、47.5％、45％、42.5％和40％五种不同密度的Percoll,如用10ml试管或塑料管分离,每层Percoll约1.2～1.5ml，初步从外周血中分离的PBMC细胞1×10８悬于１ml培基中，按要求装样、离心和取样。一般富含NK杀伤活性的LGL细胞位于42.5％与45％Percoll界面以及上下二层的Percoll液中。

　　2.　纯化淋巴母细胞和除去死细胞：分别叠加50％和30％Percoll液。收取经PHA或其它抗原、有丝分裂原刺激PBMC,或含有较高比例异型的PBMC如肾综合征出血热患者，按要求装样、离心和取样。位于管底的淋巴细胞为小淋巴细胞；两层Percoll之间为淋巴母细胞，纯度和回收率在80％以上，位于30％Percoll表面是死细胞。收获淋巴母细胞可进行表型、结构以及功能的研究。

　　四　人不同血细胞的漂浮密度

　　　　　　　　　　表　　　人不同血细胞的漂浮密度

　　　──────────────┬──────────────────

　　　细　胞　　　漂浮密度　　　　│ 细　胞　　　　　　　漂浮密度

　　　──────────────┼──────────────────

　　　红细胞　　1.09-1.11　　　　│淋巴细胞　　　　　　　1.052-1.077

　　　粒细胞　　　　　　　　　　 │ B淋巴细胞　　　　　 1.062-1.075

　　　嗜酸性　　1.09-1.095　　　 │ T淋巴细胞　　　　　 1.065-1.077

　　　嗜中性　　1.080-1.085　　　│ 淋巴母细胞　　　　　1.065-1.077

　　　单核细胞　1.050-1.066　　　│自然杀伤细胞　　　　　1.050-1.070

　　　血小板　　1.030-1.060　　　│

　　　──────────────┴──────────────────

Percoll Gradient

Contributor: Suprya Jayadev


Forming gradient

1 Add 22 ml of light Percoll to a centrifuge tube.

2 Using a 20 G 3 1/2 in spinal needle on a 10 cc syringe, carefully underlay with 6 ml of dense Percoll.

3 Centrifuge tubes at 48,000xg ~20,000 rpm in JA-20 rotor in Beckman J2-21 high speed centrifuge for 15 mins, 40C.

Fractionation

4 Carefully layer supernatant on top of the preformed gradient; without disrupting the gradient!!

－－> In addition to gradient containing sample, should also run a marker gradient loaded with colored marker beads of known density Pharmacia.

5 Centrifuge samples at 48,000xg , 40C, 15 mins, as before.

6 Collect 1 or 2 ml fractions at 40C by aspiration from the bottom of the gradients through a pipet tip attached to polyethylene tubingperistaltic pump.


Removing Percoll

7 Should have collected 19 or 38 fractions into 5/8 X 3 in,10.4 ml capacity centrifuge bottles Beckman # 355603 during the previous step.

－－> Determine the distances of bead migration in the marker gradient.

8 Weight balance tubes using Percoll balancing solution.

9 Centrifuge fractions at 180,000xg ~60,000 rpm using the 70.1 Ti rotor in the Beckman L7-65 ultracentrifuge for 30 minutes.

－－> or at 100,000xg for 90 minutes

10 Collect supernatantsdiscard pellets.

 

Reagents:

Relaxation buffer without EGTA:
100 mM KCl
3 mM NaCl
1 mM ATPNa2
3. 5 mM MgCl2
10 mM PIPES pH 7.3

Light Percoll final density 1.040 g/ml
10 ml 10X relaxation buffer with EGTA
26.4 ml undiluted Percoll density 1.130
63.6 ml dH2O
－－> relaxation buffer makes Percoll isotonic
－－> relaxation buffer should contain 12.5 mmol/l EGTA

Dense Percoll final density 1.120 g/ml
3 ml 10X relaxation buffer with EGTA
26.4 ml undiluted Percoll
0.60 ml dH2O

Percoll balancing solution final density 1.122 g/ml
5 ml 10X relaxation buffer with EGTA
45 ml undiluted Percoll

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