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抗血清的制备中离心机的应用
点击次数：1047 发布时间：2008/9/10 22:57:42
(一)实验目的
(1)了解抗血清制备的基本原理。
(2)掌握抗血清制备的操作步骤及方法。
(二)实验原理
用具有抗原性的物质注入健康动物机体后，将引起免疫应答，并会形成浆细胞，分泌抗体。抗体主要存在于血清中，经一定次数注射，使血清中的抗体组达到要求浓度，然后采集动物血液，再从血液中分离出血清，从而获得抗血清。为了获得特异性强，效价高的抗血清，除了抗原的因素外，还需注意动物品系的选择、抗原注射的浓度、剂量、次数、间隔时间及注射途径等。对于免疫原性较弱的可溶性抗原(如蛋白质类抗原)要加入佐剂，以增强免疫性。本次实验是用颗粒性抗原(苏云金芽胞杆菌鞭毛及菌体抗原)制备相应的抗血清，这类抗原的免疫原性较强，不需加入佐剂也能获得特异性强、效价高的抗血清。
（三）实验器材
(1)活材料：
1)苏云金芽胞杆菌醋螟亚种(Bacillus thuringiensis subsp.galleria血清型H5ab)、加拿大变种(Bacillus thuringiensis var.canadensis 血清型H5ac)、库斯塔克亚种(Bacillus thuringiensis subsp.kurstaki血清型H3abc)未知血清型的苏云金芽胞杆菌。
2)动物 家免(大耳白，2—3kg),健康雄性或未孕雌免。
(2)培养基：供试培养基的配方如表1所示。
表1 三种培养基配方
| 培养基 | 培养基配方 | ||||
| 牛肉膏/% | 蛋白胨/% | 氯化钠/% | 琼脂/% | pH值 | |
| 软琼脂培养基 | 1.0 | 1.0 | 0.2 | 0.5 | 7.2 |
| 摇瓶培养基 | 1.0 | 1.0 | 0.2 | / | 7.2 |
| 斜面培养基 | 1.0 | 1.0 | 0.2 | 2.0 | 7.2 |
(3)器材：注射器(5Ml)、针头(5号、12号)、剪刀、胶布、纱布、离心管、止血钳、刀片、l0mL吸管、带橡皮塞无菌试管、平皿、接种环、100mL三
角瓶(带橡皮塞)、量筒、小动物解剖台、青霉素瓶、镊子、甲醛、碘酒棉球、酒精棉球、干棉球、麦氏比浊管、生理盐水等。
(四)实验方法
(1)抗原制备：
1)鞭毛(H)抗原制备 将库斯塔克亚种、蜡螟亚种(青虫菌)、加拿大亚种及分离的苏云金芽胞杆菌从砂土管或斜面移接到牛肉膏蛋白胨斜面上培养1夜，再用稀释分离法或划线分离法获得单个菌落，按种于平板的软琼脂培养基的中央，30℃培养1夜(9-12h)。当运动性细菌扩散到距离平板边缘数毫米时，用接种环取*外边菌体。再接种于另一软琼脂平板的中央。如上法培养，再接种于第三个软琼脂平板。如此移接4-6次，*后一次则取*外边菌体接种子摇瓶(500mL三角瓶，装摇瓶培养基50mL)中，28—30℃振荡培养10-14h。培养液离心(3000 r/min，15min)，去上清液，再悬浮于50mL含0.25％的福尔马林生理盐水中，再离心15min，去上清液，将收集的菌体悬浮在10mL含0.25％福尔马林生理盐水中，制成抗原母液，置冰箱保存备用(若发现自发凝集则弃去不用)，保存抗原液使用期为4周。(说明：由于苏云金芽胞杆菌为周生鞭毛菌，鞭毛多且长，将菌体紧密地包裹着，用此法制备的抗原即代表H抗原。免疫动物后即产生相应的鞭毛抗体)。
2)菌体抗原制备 将鞭毛抗原母液分出一半，装入带棉塞的无菌空试管中，置沸水中加热1h，待冷却后即为去掉鞭毛的菌体抗原。放入冰箱保存备用。
(2)免疫家兔：
免疫前从家兔身上采集少量血液，作为对照血清(采集方法和静脉注射相似，将兔子固定，用注射器针头对准耳朵边缘静脉末梢附近插入慢慢抽出血液约3mL，分离血清)。
用鞭毛或菌体抗原免疫的注射程序如下：
时间 剂量 途径
第1天 0.5ml(浓度为麦氏比浊管第7管) 耳静脉
第5天 1.0mL 耳静脉
第9天 1.5mL 耳静脉
第13天 2.0ml 耳静脉
第17天 2.5mL 耳静脉
(3)采试血：
注射*后一次一周后采试血约3mL，方法同采对照血清。当试血效价达到1：2000以上，则可采全血，否则要加强注射1-2次。
(4)采全血：
采全血主要有以下两种方法：
1)心脏采血 采血当天早上不喂饲料。采血时由助手用左手紧抓兔颈部及两只前腿，右手握兔的后肢，使免仰卧。腹部向上，固定(或将兔固定在小动物解剖台上)。用剪刀剪去左前胸的毛，用左手在兔肋骨左侧探得心脏搏动*剧烈处，然后用碘酒棉球消毒、再用酒精棉球洗脱碘酒，右手执注射器针头(50mL注射器，12号针头，注射器与针头用3.5cm长的硅胶管连接)由该处刺入。若部位准确，则可见到心血涌入注射器中。徐徐抽取血液，达足量时(50mL左右)，由与硅胶管连接处取下注射器．慢慢注入已准备好的写有标签的无菌三角瓶或平皿中。注完后将三角瓶斜置，同时将注射器再连接到硅胶管上，再接着抽血，直到抽完。一只2kg以上的兔可抽血100mL以上。
2)颈动脉放血
将家兔固定在小动物解剖台上，腹部向上，用剪刀剪去颈部的毛．面积尽量大些。再用酒精消毒后，将颈部皮肤捏起来，从根部开始剪开直至锁骨间。弄破肌膜，让气管暴露，在气管两侧各有—根近乎桃红色的颈动脉管。手触之即可感到脉动。用镊子小心拨开颈动脉周围的肌肉和神经，然后拉出动脉。用丝线系住远心端c处（图1）。在离此处约1cm的近心端处夹上一个止血钳a，再在离a约2M的近心端夹上一个止血钳b，在a、b间开一小口，于远心端c与a之间剪断动脉，用止血钳a将动脉管小口引入三角瓶内，然后放开止血钳b，血流便由小口流入三角瓶内。注意开始血流得不要太快，以免兔子很快衰弱，使全血量减少。放血至三角瓶3-4cm高，在b处夹住血管，并将盛血三角瓶塞上橡皮塞斜置。同时再取一个三角瓶同上法继续放血．血流减弱时，可用力压迫家兔的腹
部，血液短时间即可涌出。也可由另一侧的颈动脉如上法采血，直至采完。
图1 颈动脉放血示意图
采血后的注意事项：由于血液会立即凝固，因此，采血后的注射器和针头要
立即用生理盐水抽吸几次．并将取下的针头和简芯连同剪刀、止血钳、镊子等一起泡进生理盐水中，洗净后煮沸消毒备用。 (5)抗血清的分离、保存：将三角瓶的血液斜置0.5-1h后(室温或37℃温箱)，再将三角瓶立起，并用无菌细玻棒沿瓶壁将血块与瓶壁分离，转入冰箱过夜，让血清充分析
出，用无菌吸管和毛细滴管分出血清。若血清中带有红血球，则须装入无菌离心管中离心(3000 r/min ，20min)。将血清吸入无菌三角瓶，去掉
红血球。按1:100的比例加入1％的硫柳汞或5％的叠氮纳，即*终浓度分别为0.01％和0.05％。将血清分装入青霉素瓶(或安碚瓶)，用胶布将口
封住(或将安碚瓶火焰封口)，贴上标签，注明抗血清的名称、效价及制备日期．置－20℃保存备用。以上资料由www.xiangyikj.com 长沙骏逸实验仪器有限公司转载提供，供您学习参考！
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