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氨基转移反应的定性鉴定
点击次数：554 发布时间：2008/11/21 21:31:52
一、实验目的
（1）学习一种鉴定氨基转移作用的简便方法及其原理；
（1）学习一种鉴定氨基转移作用的简便方法及其原理；
（2）进一步掌握纸层析的原理和操作技术；
（3）了解氨基转移作用在中间代谢中的意义。
二、实验原理
氨基移换酶也称转氨酶,它能催化α-氨基酸的氨基与α-酮酸的α-酮基互换，这种作用称为氨基移换作用。它在生物体内蛋白质的合成与分解等中间代谢中，在糖、脂肪、蛋白质三类物质代谢的相互联系、相互转化上，都起着很重要的作用。任何一种氨基酸进行转氨作用时，都由其专一的转氨酶催化。它们的*适pH接近7.4。在各种转氨酶中，以谷氨酸—草酰乙酸转氨酶（简称谷草转氨酶、GOT）及谷氨酸—丙酮酸转氨酶（简称谷丙转氨酶、GPT）活力*强。
氨基移换酶也称转氨酶,它能催化α-氨基酸的氨基与α-酮酸的α-酮基互换，这种作用称为氨基移换作用。它在生物体内蛋白质的合成与分解等中间代谢中，在糖、脂肪、蛋白质三类物质代谢的相互联系、相互转化上，都起着很重要的作用。任何一种氨基酸进行转氨作用时，都由其专一的转氨酶催化。它们的*适pH接近7.4。在各种转氨酶中，以谷氨酸—草酰乙酸转氨酶（简称谷草转氨酶、GOT）及谷氨酸—丙酮酸转氨酶（简称谷丙转氨酶、GPT）活力*强。
三、试剂与器材
解剖器具、离心机、恒温水浴、干燥箱、台秤、层析系统等。
解剖器具、离心机、恒温水浴、干燥箱、台秤、层析系统等。
1/15mol/L磷酸缓冲液（pH=7.4）、1%谷氨酸溶液（用KOH中和至中性）、1%丙酮酸溶液（用KOH中和至中性）、0.1%碳酸氢钾溶液、0.05%碘乙酸溶液、15%三氯醋酸溶液、标准丙氨酸溶液(0.1%)、标准谷氨酸溶液(0.1%)、0.1%水合茚三酮乙醇溶液、酚溶剂。
四、操作方法
将兔击晕，迅速解剖，取出肝脏，在低温条件下剪碎。称取匀浆后，离心取上清液，即为制备的酶液。体外氨基移换反应。纸上层析法检查每人4个点（标准丙氨酸溶液、标准谷氨酸溶液、对照上清液、样品上清液）。点样放入层析罩内。用被酚所饱和的水溶液，平衡后，用带小漏斗的玻璃管从层析罩上加饱合酚试剂25ml于层析缸内。然后，立即盖紧塞子，当溶剂前沿达到距滤纸上端约2.5cm处，取出滤纸，晾干或吹干，以除去酚溶剂，喷洒0.1%茚三酮乙醇溶液，放入烘箱中显色氨基酸与茚三酮反应，在滤纸上呈现紫红色斑点。
将兔击晕，迅速解剖，取出肝脏，在低温条件下剪碎。称取匀浆后，离心取上清液，即为制备的酶液。体外氨基移换反应。纸上层析法检查每人4个点（标准丙氨酸溶液、标准谷氨酸溶液、对照上清液、样品上清液）。点样放入层析罩内。用被酚所饱和的水溶液，平衡后，用带小漏斗的玻璃管从层析罩上加饱合酚试剂25ml于层析缸内。然后，立即盖紧塞子，当溶剂前沿达到距滤纸上端约2.5cm处，取出滤纸，晾干或吹干，以除去酚溶剂，喷洒0.1%茚三酮乙醇溶液，放入烘箱中显色氨基酸与茚三酮反应，在滤纸上呈现紫红色斑点。
五、关键步骤与注意事项
① 取动物新鲜组织制备酶液，防止酶失活。
② 加碘乙酸抑制酶解作用。
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