4.请每次测定的同时做标准曲线,最好做复孔。如标本中待测物质含量过高(样本OD值大于标准品孔第一孔的OD值),请先用样品稀释液稀释一定倍数(n倍)后再测定,计算时请最后乘以总稀释倍数(×n×5)。
1. 标本的采取和保存
可用作 ELISA 测定的标本十分广泛,体液(如血清)、分泌物(唾液)和排泄物(如尿液、粪便)等均可作标本以测定其中某种抗体或抗原成份。有些标本可直接进行测定(如血清、尿液),有些则需经预处理(如粪便和某些分泌物)。大部分 ELISA 检测均以血清为标本。血浆中除尚含有纤维蛋白原和抗凝剂外,其他成份均同等于血清。制备血浆标本需借助于抗凝剂,而血清标本只要待血清自然凝固、血块收缩后即可取得。除特殊情况外,在医学检验中均以血清作为检测标本。在 ELISA 中血浆和血清可同等应用。血清标本可按常规方法采集,应注意避免溶血,红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质,以 HRP 为标记的 ELISA 测定中,溶血标本可能会增加非特异性显色。血清标本宜在新鲜时检测。如有细菌污染,菌体中可能含有内源性 HRP,也会产生假阳性反应。如在冰箱中保存过久,其中的可发生聚合,在间接法 ELISA 中可使本底加深。一般说来,在5 天内测定的血清标本可放置于4℃,超过一周测定的需低温冰存。冻结血清融解后,蛋白质局部浓缩,分布不均,应充分混匀宜轻缓,避免气泡,可上下颠倒混和,不要在混匀器上强烈振荡。混浊或有沉淀的血清标本应先离心或过滤,澄清后再检测。反复冻融会使抗体效价跌落,所以测抗体的血清标本如需保存作多次检测,宜少量分装冰存。保存血清自采集时就应注意无菌操作,也可加入适当防腐剂。
2. 试剂的准备
按试剂盒说明书的要求准备实验中需用的试剂。ELISA 中用的蒸馏水或去离子水,包括用于洗涤的,应为新鲜的和高质量的。自配的缓冲液应用 pH 计测量较正。从冰箱中取出的试验用试剂应待温度与室温平衡后使用。试剂盒中本次试验不需用的部分应及时放回冰箱保存。
3. 加样
在 ELISA 中一般有3次加样步聚,即加标本,加酶结合物,加底物。加样时应将所加物加在 LEISA 板孔的底部,避免加在孔壁上部,并注意不可溅出,不可产生气泡。加标本一般用微量加样器,按规定的量加入板孔中。每次加标本应更换吸嘴,以免发生交叉污染,也可用一次性的定量塑料管加样。有此测定(如间接法 ELISA)需用稀释的血清,可在试管中按规定的稀释度稀释后再加样。也可在板孔中加入稀释液,再在其中加入血清标本,然后在微型震荡器上震荡 1 分钟以保证混和。加酶结合物应用液和底物应用液时可用定量多道加液器,使加液过程迅速完成。
4. 保温
(1)在 ELISA 中一般有两次抗原抗体反应,即加标本和加酶结合物后。抗原抗体反应的完成需要有一定的温度和时间,这一保温过程称为温育(incubation),有人称之为孵育, 在 ELISA中似不恰当。ELISA 属固相免疫测定,抗原、抗体的结合只在固相表面上发生。以抗体包被的夹心法为例,加入板孔中的标本,其中的抗原并不是都有均等的和固相抗结合的机会,只有最贴近孔壁的一层溶液中的抗原直接与抗体接触。这是一个逐步平衡的过程,因此需经扩散才能达到反应的终点。在其后加入的酶标记抗体与固相抗原的结合也同样如此。这就是为什么 ELISA反应总是需要一定时间的温育。
(2)温育常采用的温度有 43℃、37℃、室温和 4℃(冰箱温度)等。37℃是实验室中常用的保温温度,也是大多数抗原抗体结合的合适温度。在建立 ELISA 方法作反应动力学研究时,实验表明,两次抗原抗体反应一般在 37℃经 1-2 小时,产物的生成可达顶峰。为加速反应,可提高反应的温度,有些试验在 43℃进行,但不宜采用更高的温度。抗原抗体反应 4℃更为彻底,在放射免疫测定中多使反应在冰箱中过夜,以形成最多的沉淀。但因所需时间太长,在 ELISA 中一般不予采用。
(3)保温的方式除有的 ELISA 仪器附有特制的电热块外,一般均采用水浴,可将 ELISA 板置于水浴箱中,ELISA 板底应贴着水面,使温度迅速平衡。为避免蒸发,板上应加盖,也可用塑料贴封纸或保鲜膜覆盖板孔,此时可让反应板漂浮在水面上。若用保温箱,ELISA 板应放在湿盒内,湿盒要选用传热性良好的材料如金属等,在盒底垫湿的纱布,最后将 ELISA 板放在湿纱布上。湿盒应先放在保温箱中预温至规定的温度,特别是在气温较低的时候更应如此。无论是水浴还是湿盒温育,反应板均不宜叠放,以保证各板的温度都能迅速平衡。室温温育的反应,操作时的室温应严格限制在规定的范围内,标准室温温度是指 20-25℃,但具体操作时可根据说明书的要求控制温育。室温温育时,ELISA 板只要平置于操作台上即可。应注意温育的温度和时间应按规定力求准确。为保证这一点,一个人操作时,一次不宜多于两块板同时测定。
供应产品信息人皮质醇(Cortisol)ELISA试剂盒DM01449人血管紧张素Ⅰ(Ang-Ⅰ)ELISA试剂盒96T/48T
DM01450人卵泡抑素(FS)ELISA试剂盒96T/48T
DM01451人甲状腺素抗体(TAb)ELISA试剂盒96T/48T
DM01452人儿茶酚胺(CA)ELISA试剂盒96T/48T
DM00475人半胱氨酸蛋白酶抑制剂/胱抑素C(Cys-C)ELISA试剂盒96T/48T
DM01453人乙酰胆碱受体抗体(AChRab)ELISA试剂盒96T/48T
DM01454人5羟色胺(5-HT)ELISA试剂盒96T/48T
DM00446人甲状腺过氧化物酶(TPO)ELISA试剂盒96T/48T
DM01455人抑制素A(INH-A)ELISA试剂盒96T/48T
DM01456人性激素结合球蛋白(SHBG)ELISA试剂盒96T/48T
DM01457人脱氢表雄酮S7(DHEA-S7)ELISA试剂盒96T/48T
DM01458人脱氢表雄酮(DHEA)ELISA试剂盒96T/48T
DM01459人生长抑素(SS)ELISA试剂盒96T/48T
DM01460人生长激素释放多肽(GHRP) ELISA试剂盒96T/48T
DM01461人促甲状腺素释放激素(TRH)ELISA试剂盒96T/48T
DM01462人血栓素B2(TXB2)ELISA试剂盒96T/48T
DM01463人双氢睾酮(DHT)ELISA试剂盒96T/48T
DM01464人促生长激素释放激素(GHRH)ELISA试剂盒96T/48T
DM01465人雌激素(E)ELISA试剂盒96T/48T
DM00527人孕激素/孕酮(PROG)ELISA试剂盒96T/48T
DM01466人促甲状腺素(TSH)ELISA试剂盒96T/48T
DM01467人皮质醇(Cortisol)ELISA试剂盒96T/48T
DM01468人雌二醇(E2)ELISA试剂盒96T/48T
DM01469人脱氢表雄酮硫酸酯(DHEA-S)ELISA试剂盒96T/48T
DM01470人睾酮(T)ELISA试剂盒96T/48T
DM01471人游离睾酮(F-TESTO)ELISA试剂盒96T/48T
DM01472人雄烯二酮(ASD)ELISA试剂盒96T/48T
DM01473人雌三醇(E3)ELISA试剂盒96T/48T
DM01474人17羟孕酮(17-OHP)ELISA试剂盒96T/48T
DM01475人三碘甲状腺原氨酸(T3)ELISA试剂盒96T/48T
DM01476人甲状腺素(T4)ELISA试剂盒96T/48T
DM01477人游离甲状腺素(FT4)ELISA试剂盒96T/48T
DM01478人游离三碘甲状腺原氨酸(Free-T3)ELISA试剂盒96T/48T
DM01479人新生甲状腺素(NN-T4)ELISA试剂盒96T/48T
DM01480人胰岛素(INS)ELISA试剂盒96T/48T
DM01481人C肽(C-Peptide)ELISA试剂盒96T/48T
DM01482人绒毛膜促性腺激素(HCG)ELISA试剂盒96T/48T
DM01483人绒毛膜促性腺激素β(β-HCG)ELISA试剂盒96T/48T
DM01484人促黄体激素(LH)ELISA试剂盒96T/48T
DM00497人前列腺素F2α(PGF2α)ELISA试剂盒 96T/48T
DM00317人伴侣蛋白10(CPN10)ELISA试剂盒96T/48T
DM01485人胎盘核糖核酸抑止剂(HPRI)ELISA试剂盒 96T/48T
DM01486人胎盘蛋白(PP)ELISA试剂盒 96T/48T
DM00434人胎盘催乳素(HPL)ELISA试剂盒 96T/48T
DM01487人孕酮受体(PGR)ELISA试剂盒 96T/48T
DM01488人新生儿促甲状腺素(N-TSH)ELISA试剂盒 96T/48T
DM01489人胎盘碱性磷酸酶(PLAP)ELISA试剂盒 96T/48T
DM01490人妊娠特异性β1糖蛋白(SP1/PSβ1-G)ELISA试剂盒96T/48T
DM01491人胎盘泌乳素(PL)ELISA试剂盒96T/48T
DM01492人雄激素结合蛋白(ABP)ELISA试剂盒96T/48T
DM01493人抗透明带抗体(aZP)ELISA试剂盒96T/48T