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灭菌时，温度和湿度要求很重要，当温度低于35℃或相对湿度低于25%时，达不到灭菌效果，即使延长灭菌时间也无效。加EO，必须先微开钢瓶阀，再开箱体阀，使EO充分汽化后进入箱体，切忌加药过快，以保证气化效果。当箱体进行5次置换后，确保箱体压力为零的情况下，关闭门封充气开关并吸门封，再将开门旋动开门开关开门。
环氧乙烷灭菌操作必须按照操作规范操作，随时有人注意压力表。环氧乙烷对人体的毒性作用主要为直接接触或吸入，环氧乙烷气体能刺激呼吸道，灭菌操作过程中，应做好防护措施，环氧乙烷液体若不慎溅到皮肤上或眼睛内，应立即用水冲洗。环氧乙烷易燃易爆，当空气中的含量为3%-80%时，就形成爆炸性混合气体，遇明火时发生燃烧或爆炸。所以必须保证消毒车间的通风状况、绝对禁止接触明火，灭菌环境必须保证所有开关为防爆开关、所有灯具为防爆灯具。
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