三聚氰胺检测试剂盒

齐一生物销售：021－6034 8496；181214 53965；173021 04490

（请以英文为准，中文仅供参考）

试剂盒特点【三聚氰胺检测试剂盒】

1.AP单克隆抗体特异地与AP结合，和其它结构相类似的化学物质不发生交叉反应。单克隆抗体质量稳定每批次见几乎没有变化。

2.检测范围5μg/L - 500μg/L (ppb) 。通过固相萃取浓缩可以检测更低的浓度。

3.这个试剂盒有很高的重复性，变异系数在10%之内。

4.操作简单，整个过程仅花费2.5小时

5.试剂盒的形式是96孔微孔板，可以同时检测多个样品，花费合理。

检测原理 （竞争ELISA）

1. 竞争性反应

这个检测方法依靠单克隆抗体来识别AP。样品中的AP和一个AP-酶结合物预先混合然后加入到每个微孔中竞争包被在微孔表面的特异性抗体。样品中AP的浓度如果高于AP-酶结合物，AP将主要与抗体结合。反之样品中AP的浓度如果低于于AP-酶结合物，AP-酶结合物将主要与抗体结合。

2. 显色反应

通过洗涤步骤去除没有反应的AP和过多的AP-酶结合物。通过加入底物来检测AP。和微孔板中抗体结合的AP-酶结合物催化底物发生反应产生有色物质。通过一个孵育期用稀酸终止反应。样品中AP的浓度越高导致结合到微孔板抗体上的AP-酶结合物越少，从而产生的颜色越淡，吸光度越低。

3. 定量分析

利用已知浓度的AP标准的浓度和在450nm条件下获得的吸光度值做出一条剂量反应曲线（标准曲线）。把样品的吸光度值用内插法插入到标准曲线中可以精确的计算出样品中AP的浓度。

AP 检测流程【三聚氰胺检测试剂盒】

1.样品处理

在操作前半小时从冰箱中拿出试剂盒使其恢复到室温（18-25°C）。过滤样品，加入甲醇和DMSO使甲醇的最终浓度为10% (v/v),DMSO的最终浓度为1%(v/v)。对于一些样品进行固相萃取是必要的。

2. 标准溶液

利用甲醇溶液（甲醇：水 0.8：8.2）把AP标准浓缩液稀释10倍。然后对此溶液进一步稀释成设定的AP标准的浓度（5μg/L- 500μg/L）。在配制的时候先加甲醇溶液后加标准。

3. 抗原-酶结合物溶液

重新配制一瓶抗原-酶结合物溶液：抗原-酶结合物粉末(#3) + 缓冲液(#4, 白盖).

4. 标准/样品 与结合物混合

在没有包被的微孔板中(#8)混合100μL AP标准（或样品）和100μL酶结合物溶液。先加结合物后加标准或样品。

5. 竞争反应

在包被抗体的微孔板(#1)的每个孔中加入100μL在第四步中混合的溶液，在室温(18-25°C)孵育60分钟。

6. 洗液

用蒸馏水以1：5的比例稀释洗液（6倍浓缩）：1ml 洗液(#5) + 5ml蒸馏水

7. 没有结合的物质

每个微孔用300μL的洗液冲洗，并重复两次。在吸水纸上用力的排板出去微孔中的液体。

8. 显色

每个微孔加入100μL显色试剂(#6, 棕色瓶)，在室温(18-25°C)孵育30分钟。然后加入每孔再100μL的终止液(#7, 黑盖)终止反应。

10. 定量

在450nm测定每个标准的吸光度值制作标准曲线。利用内插法把样品的吸光度值代入标准曲线计算样品中AP的含量。

所需材料【三聚氰胺检测试剂盒】

必需 – 样品浓缩时不需要

1.一次性玻璃试管(e.g. IWAKI, item No. 9831-1207)确保要使用一次性试管避免AP的吸附作用

2.玻璃纤维滤器(e.g. ADVANTEC Co., item No. 36481047 Φ47mm)和过滤设备

3.微量加液器(20μL - 200μL 和100μL - 1000μL, e.g. Gilson Pipetman P-200, P-1000)和吸头

(e.g. ICN Superpack 96NS)

4.排枪(50μL - 300μL)

5.酶标仪（450nm波长）(e.g. TECAN Sunrise Remote)

6.计时器

7.Strip ejector (e.g. COSTAR, No.2578)

8.甲醇Methanol (HPLC grade)

9.DMSO(HPLC grade)

2）必需- 通过SPE 浓缩时需要

n         以上的材料都需要,再加上下面的材料

n         固体萃取柱(e.g. NEXUS SPE Cartridge Producer: VARIAN PART#:1210-3102 ABS ELUT- NEXUS, 200MG 6ML,30/PK)

n         丙酮(HPLC grade)

n         二氯甲烷(analytical reagent)

3、重要性

如果在试验过程中使用一些没有使用过的厂家生产的产品试剂时需要做比较试验。

检测步骤【三聚氰胺检测试剂盒】

重要性

1.仅用于研究、不用于个人

2.在操作前半小时从冰箱中拿出试剂盒使其恢复到室温（18-25°C）。

3.不同试剂盒的中的试剂不要混用

4.储存在2-8 °C

5.不使用过期产品

6.使用完试剂盒后根据当地的法规处理废液。

7.为了增加准确性推荐在检测中做两个重复。

注意

在试验中要穿保护性衣服，戴手套和眼镜保证和试剂盒中的液体接触。

1．样品前处理

利用特定的玻璃纤维滤纸(1μm 孔径)过滤水样，加入DMSO和甲醇使DMSO终浓度为1% (v/v)、甲醇终浓度

为10% (v/v)。如果滤液要求浓缩和清洗需要固相萃取。

例子

1）将上面制备滤液过NEXUS cartridge柱（已经用二氯甲烷(ex. 10ml)、甲醇(ex. 5ml)、蒸馏水(ex. 5ml)提前处理好的），流速10mL/min

2）用蒸馏水(ex. 5ml)和50%蒸馏水/甲醇(ex. 5ml)洗柱。真空干燥柱不超过45分钟。

3）用二氯甲烷(ex. 6ml)洗脱分析物、然后用氮气（在30摄氏度或更低的温度）吹干。

4）加入甲醇和DMSO溶液溶解残留物，调节溶液的终浓度到1%DMSO和10%甲醇溶液。

2.  标准溶液

制备甲醇溶液（甲醇：蒸馏水=0.8 ml/8.2ml）以备稀释标准(#2, 10% v/v DMSO, 20% v/v

methanol)使用。利用上面制备的甲醇溶液以1：9的比例稀释AP标准(#2)来配制设定的AP标准溶液(1% v/v DMSO, 10% v/v methanol)。

1）在配制标准溶液的过程中先加甲醇溶液后加标准(#2)。这样可以减少AP对试管壁的吸附。

2）推荐使用一次性玻璃试管来稀释标准，可以减少吸附和污染。

3）如果不经过10倍稀释储存液的步骤直接稀释到设定的标准溶液的浓度，那么标准的真实浓度将要比计划的浓度要大，所测定的吸光度的值要小0.2-0.5。确保要先稀释10倍。

4） 在测定前制备AP标准溶液，一旦标准溶液从浓缩的状态稀释后就不再稳定了，不易保存很长时间。每个检测过程都要配制新的标准溶液。

5） 用移液器吸头混匀，不要涡旋震荡器用剧烈震荡来减少样品中AP对试管壁表面的吸附。

6） 在使用完之后要确保标准浓缩液的盖拧紧并放在冰箱，标准溶液必须被密封或把盖拧紧以免甲醇挥

发。

7）保证标准溶液中甲醇的浓度为10%。过高的甲醇浓度可以损害抗体，太低的浓度导致结果读数不正确。

8）不要随意处理试验废液，要按当地的法规来处理。

3. 抗原-酶结合物

重新配制一瓶抗原-酶结合物溶液：抗原-酶结合物粉末(#3) + 7ml缓冲液(#4, 白盖)。

1.配制好的溶液要储存在2-8°C，可以稳定地保存2周。

2.  7mL足够50个孔使用。

3.         用移液器吸头混匀，转移液体时不要产生气泡。

4.在使用的时候配制。

4. 标准/样品 与结合物混合

在没有包被抗体的微孔板中(#8)加入100ul酶结合物溶液，然后再加入100ul在第二步中配制的AP标准溶液或100μL样品（制备的1% (v/v) DMSO 和10 % (v/v) 的甲醇溶液）。用移液器吸头混匀。

1.首先加入结合物溶液然后加入标准或样品避免孔的内表面的非特异性吸附。

2.用移液器吸头混匀，转移液体时不要产生气泡。

3.用1% DMSO 和10%的甲醇溶液做一个空白。

5. 竞争反应【三聚氰胺检测试剂盒】

在包被抗体的微孔板(#1)的每个孔中加入100μL在第四步中混合的溶液，轻轻是震荡微孔板使其内部的液体混匀，在室温(18-25°C)孵育60分钟。

1.包被抗体的酶标板共有12条，每条有8个孔，在检测前取出所需的孔。然后把不用的再重新放好。

2.在转移液体时要确保不产生气泡，因此操作要轻。

3.用胶带覆盖微孔板避免污染和液体挥发。

4.在反应期间不要移动和振动微孔

5.温度控制在18-30°C

6.严格反应时间

6. 洗液

用蒸馏水以1：5的比例稀释洗液（6倍浓缩）(#5)：20ml 洗液(#5) + 100ml蒸馏水 。每次检测配制所需体积的溶液，每个孔每次要求1.2mL的洗液，整个板需要120 mL。洗液要保存在2-8°C，在配制后大约可以稳定保持一个月的时间。

7. 没有结合的试剂

每个微孔用300μL的洗液冲洗，并多重复两次。在吸水纸上用力的拍板除去微孔中的液体。

1.要确保除去任何遗留液体，否则可能引起测量错误。

2.确保微孔板底部干净，不要有手印或其它污垢，否则吸光度将有很大改变。

3.不要倾倒任何没有处理的废液，例如：浸泡的布或纸要燃烧掉。

8. 显色反应

在每个微孔中加入100ul显色液(#6, brown vessel)。在室温下孵育30min。然后每个微孔加入100ul终止液(#7,黑盖)终止反应。

1.孵育温度控制在18-30°C

2.要使每个孔的反应时间一致，尤其在测试多个样品的时候

3.加入终止液后孔中的蓝色转变为黄色

9. 定量【三聚氰胺检测试剂盒】

在450nm用酶标仪测定每个标准和样品的吸光度值。

1.在终止反应15分钟内测定吸光度值。

2.每次检测制作标准曲线的标准至少做两个重复。

3.确保微孔底面没有手印和污物，否则测定的吸光度值有很大的改变。

4.样品的检测范围5μg/L - 500μg/L，样品中AP的浓度超过500μg/L时要用10%甲醇+1% DMSO稀释后再测定。对于完全不知情的样品做前处理时要做远不止一倍的稀释。

计算样品中AP浓度的方法

（1）电脑计算

利用酶标仪分析软件，用Log-Log (or Log-Linear)曲线。

（2）利用附带的曲线图计算

9020702       Table plate, complete, C12              CNY                           

9016654       Microplate Station 8000, tall            CNY                           

9016584       Plate Stacker, RCS1          CNY                            【三聚氰胺检测试剂盒】

9016521       Bucket  Set (2), for microplate, QNG            CNY                           

9016483       Adapter PCB, Gateway, Kloehn              CNY                           

9016387       EZ1 DNA Investigator Card              CNY                           

9016308       TFT Monitor, 17"        CNY                           

9016172       Software QIAsoft M48        CNY                           

9019175       Lens array, PyroQ96MD           CNY                           

9011925       Holder, bottle 30ml             CNY                           

9011891       Tubing, teflon, M6, 3 x 0.5 mm, 0.1 m            CNY                           

9011872       Shaker, Tube Rack for Plato 3        CNY                           

9011860       Cooling/heating unit, BR8000 v1.01              CNY                           

9236850       Elution Microplate Adapter 3000, SBS           CNY                           

9019141       PCB 1 - Connection w. valves, PyroQ96ID           CNY                           

9019130       Cable - Pressure, PyroQ96ID          CNY                           

9019118       Motor - X/Y, PyroQ96ID            CNY                           

9019073       PyroMark Plate Bin, PyroQ96MD            CNY                           

9022698       36- Well Rotor, Calibration Only             CNY                            【三聚氰胺检测试剂盒】

9019015       Cartridge rack, EZ1xl         CNY                           

9018947       Adapter 100-Well Honeycomb-Well Plate             CNY                           

9016049       X-Box, BR8 RD v1.02         CNY                           

9015919       Valve, magnet, dispenser, BR8000 V2          CNY                           

9015884       Incubator Tower, RCS1            CNY                           

9015810       Precision Pipetting Upgrade Kit              CNY                           

9015555       Cable , Clamp Motor, highflex, BR8000RD           CNY                           

9019161       Gasket - Tips, PyroQ96MD              CNY                           

9019152       PCB - Instrument Control, PyroQ96MD          CNY                           

9014137       Spare parts tubing kit Digene          CNY                           

9014094       Vacuum manifold, strip kit         CNY                           

9021161       Sample Tray, QE        CNY                           

9021108       Skin Panel, Top, DCU        CNY                           

9021011       Controller, Y Axis, DCU             CNY                           

QY-x149       BALB/3T3BALB/C小鼠胚成纤维细胞      CCL-163.2                               

QY-x150       Ana-1巨噬细胞                                      

QY-x151       SRSV/3T3SRSV转化的3T3细胞                                      

QY-x152       3T6-Swiss albino胚胎成纤维细胞    CCL-96                             

QY-x153       PA317成纤维细胞      CRL-9078                                

QY-x154       3T3-Swiss albino胚胎成纤维细胞    CCL-92                             

QY-x155       Mo-MuLv/3T3Mo-MuLv感染的3T3细胞                                          

QY-x156       MRC-5胚肺细胞  CCL-171                                  

QY-x157       WI-38胚肺细胞    CCL-75                             

QY-x158       FRhK-4恒河猴胚肾细胞     CRL-1688                                 【三聚氰胺检测试剂盒】

QY-x159       VERO C1008 E6非洲绿猴肾细胞    CRL-1586                                

QY-x160       Pt K1 NBL-3长鼻袋鼠肾细胞     CCL-35                             

QY-x161       L1210白血病细胞       CCL-219                                  

QY-x162       Neuro-2A脑神经瘤细胞     CCL-131                                  

QY-x163       PC-12肾上腺嗜铬细胞瘤细胞   CRL-1721                                

QY-x164       HeLa宫颈癌细胞                                    

QY-x165       A549 [A-549]肺癌细胞       CCL-185                                  

QY-x166       MCF7乳腺癌细胞       HTB-22                             

QY-x167       Hep 3B2.1-7肝癌细胞        HB-8064                                  

QY-x168       MDA-MB-231乳腺癌细胞   HTB-26                             

QY-x169       Hep G2肝癌细胞        HB-8065                                  

QY-x170       HCT 116结肠癌细胞   CCL-247                                  

QY-x171       22RV1前列腺癌细胞   CRL-2505                                

QY-x172       HT-29结肠癌细胞       HTB-38                             

QY-x173       KG-1白血病细胞  CCL-246                                  

QY-x174       LoVo结肠癌细胞  CCL-229                                   【三聚氰胺检测试剂盒】

QY-x175       THP-1单核细胞白血病       TIB-202                             

QY-x176       SW620结肠癌细胞     CCL-227                                  

QY-x177       SK-N-SH神经母细胞瘤细胞       HTB-11                             

QY-x178       SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞      CRL-2266                                

QY-x179       COLO 205结肠癌细胞       CCL-222                                  

QY-x180       T/G HA-VSMC人主动脉血管平滑肌细胞        CRL-1999                                

QY-x181       HUVEC人脐静脉血管内皮细胞  CRL-1730