CCK-8试剂盒

Cell Counting Kit -8

检测原理

CCK-8试剂盒是一种基于WST-8的广泛应用于细胞增殖和细胞活性的快速高灵敏度检测试剂盒。

WST-8属于MTT的升级产品，能在电子载体1-甲氧基PMS的作用下被还原成水溶性甲臜产物，生成的甲臜量与活细胞数量成正比，因此颜色的深浅与细胞的增殖成正比，与细胞毒性成反比。使用酶标仪在450 nm波长处测定OD值，可以反映活细胞数量。

CCK-8法与普通的MTT法相比，具有显著特点：

★灵敏度高，数据可靠，重现性好

★操作简便，省时省力

★水溶性，不需要换液，尤其适合于悬浮细胞

★无需放射性同位素和有机溶剂，对细胞毒性低

★为1瓶溶液，毋需预制，即开即用

★适合于高通量药物筛选

CCK-8用途：药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验

保存条件：

4ºC避光保存一年有效， -20ºC避光保存两年有效。 避免反复冻融。

CCK-8试剂盒操作说明

CCK-8溶液可直接加到细胞中，不需要与其它组分预混。由于CCK-8溶液非常稳定并且细胞毒性很小，所以可以进行长时间孵育，例如孵育24-48小时。

在进行以下实验之前，可先设置空白对照孔，仅加入相应量细胞培养液、药物和CCK-8溶液，不加入细胞。

方法一. 制作标准曲线（测定细胞具体数量）

1、先用细胞计数板计数所制备的细胞悬液中的细胞数量，然后接种细胞到培养板内。

2、按比例（例如：1/2比例）依次用培养基等比稀释成一个细胞浓度梯度，一般要做3-5个细胞浓度梯度，每个浓度建议3-6个复孔。

3、接种后培养2-4小时使细胞贴壁，然后按培养基体积的10%加入CCK-8试剂，培养一定时间后测定OD值，制作出一条以细胞数量为横坐标（X轴），OD值为纵坐标（Y轴）的标准曲线。根据此标准曲线可以测定出未知样品的细胞数量（使用此标准曲线的前提是实验的条件要一致，便于确定细胞的接种数量以及加入CCK-8后的培养时间。）

方法二. 细胞活性检测

1、在96孔板中接种细胞悬液（100 μL/孔）。将培养板放在培养箱中预培养一段时间（37℃,5% CO2）。

2、向每孔加入10 μL CCK-8溶液。

3、将培养板在培养箱内孵育1-4小时。

4、用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。

方法三. 细胞增殖-毒性检测

1、在96孔板中加入90 μL的细胞悬液。将培养板放在培养箱预培养24小时（37℃，5% CO2）。

2、向培养板加入10 μL不同浓度的待测物质。

3、将培养板在培养箱中孵育适当的时间（例如：6、12、24或48小时）。

4、向每孔加入10 μL CCK-8溶液。

5、将培养板在培养箱内孵育1-4小时。

6、用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。

活力计算：

细胞活力(%)=[A(加药)-A(空白)]/[A(不加药)-A(空白)] ×100

A(加药)：具有细胞、CCK 溶液和药物溶液的孔的吸光度

A(空白)：具有培养基和CCK 溶液而没有细胞的孔的吸光度

A(0 加药)：具有细胞、CCK 溶液而没有药物溶液的孔的吸光度

细胞活力：细胞增殖活力或细胞毒性活力

注意事项:

1，由于使用96孔板进行检测，如果细胞培养时间较长，一定要注意蒸发问题。一方面，由于96孔板周围一圈最容易蒸发，可以采取弃用周围一圈的办法，改加相同量的PBS、 水或培养液；另一方面，可以把96孔板置于靠近培养箱内水源的地方，以缓解蒸发。

2，本试剂盒的检测依赖于脱氢酶催化的反应， 所以还原剂(例如一些抗氧化剂)会干扰检测。如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加CCK-8之前更换新鲜培养基（除去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的培养基），去掉药物影响。当然药物影响比较小的情况下，可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。培养基中酚红和血清的吸光度，在计算时通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不会对检测造成影响。

3，有条件的情况下建议采用多通道移液器，可以减少平行孔间的差异。加入CCK-8试剂时，建议斜贴着培养板壁加，不要插到培养基页面下加，容易产生气泡，会干扰OD值读数。加完之后最好能够离心，以免CCK-8液滴悬挂在壁上。用酶标仪检测前需确保每个孔内没有气泡，否则会干扰测定。

4，若暂时不测定OD值，可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。24小时内测定，吸光度不会发生变化。

5，建议先做几个孔摸索接种细胞的数量和加入CCK-8试剂后的培养时间。白细胞可能需要培养较长时间。若使用24孔板或6孔板实验，请先计算每孔相应的接种量，并按照每孔培养基总体积的10%加入CCK-8溶液。

6，若没有450nm的滤光片，可使用吸光度在430-490 nm之间的滤光片，但是450nm滤光片的检测灵敏度最高。

7，金属对CCK-8显色有影响。终浓度为1 mM的氯化亚铅、氯化铁、CuSO4会抑制5%、15%、90%的显色反应，使灵敏度降级。如果终浓度是10 mM的话，将会100%抑制。

8，本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品。为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

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