Cytoskeleton 艾美捷 Vav2蛋白实验原理

Cytoskeleton/艾美捷Vav2蛋白是种对Rac1有选择性的鸟嘌呤交换因子，在多种条件下介导Rac1激活，并与胃肿瘤以及细胞体积控制和神经轴突延伸有关：

1.Vav2 GTP/GDP交换活性抑制剂的研究

2.Vav2 DH结构域结合蛋白的鉴定

3.不同GTP酶对Vav2-GEF活性的研究

Cytoskeleton 覆盖肌动蛋白，微管蛋白，马达蛋白，小G蛋白，细胞外基质，活细胞成像等相关域，提供对应的蛋白质，抗体，检测与分析试剂盒。

Cytoskeleton/艾美捷Vav2蛋白生物活性测定：

Vav2 DH的生物活性可以通过其催化Rac1上核苷酸交换的能力来确定，使用Bodipy GDP的核苷酸交换试验检测过量的GDP或GTP。Rac1蛋白质通过添加过量的EDTA预加载Bodipy FL GDP，例如，反应中每mmol Mg2+离子添加0.7 mmol EDTA。然后以解离分析的形式使用该子储备溶液，这表明与未标记的核苷酸竞争交换位点。反应通过485nm Ex/535nm Em下的荧光测量进行监测。严格的质量控制确保在存在0.8µM Vav2 DH的情况下，Bodipy GTP或mant GTP的交换率至少提高五倍。

方法：

1.将Vav2小瓶放在冰上，用冰冷交换缓冲液稀释至0.30微克/微升（8微升）。

2.用冰冷交换缓冲液将Rac蛋白稀释至1.25µg/µl（50µM）。

3.在新鲜的15毫升Falcon管中加入以下成分，并通过移液管或轻轻旋涡充分混合：

每口井的成分微升交换缓冲区75

50µM Rac 5

8µM Vav2 10

注：对于总混合物体积，将每个孔的试剂体积乘以实验中的孔数，再加上20%的体积以计算移液损失。

4.在室温（RT）下培养20分钟。

5.通过添加10µl（每孔）50 mM MgCl2锁定核苷酸。

6.设置荧光计，激发波长为485 nm+/-15 nm，发射波长为525 nm+/-15 nm。

7.将预加载的混合物等分到指定的孔中，并将平板放入荧光计中。

8.在5个周期（150）后，将程序置于保持或暂停状态，然后卸下平板。

9.移取10µl a）5 mM GTP溶液，b）小化合物，c）测试蛋白质，d）4 mM EDTA（+ve交换对照）或e）稀释缓冲液（阴性对照）于各孔中，并立即上下移液两次，然后继续读取20分钟。

10.完成动力学方案后保存读数。通过将数据减少到大斜率（使用12个点）或Vmax，并使用读板器附带的软件，可以计算汇率。交换曲线可以通过导出到Microsoft Excel来实现。

艾美捷科技是Cytoskeleton的中国代理商，为科研工作者提供优质的产品与服务。

来源：https://www.amyjet.com/brand/Cytoskeleton-china-distributor.shtml