SOS1 Ras GEF蛋白的应用和制备方法

1.SOS1 GTP交换活性抑制剂的研究

2.SOS1结合蛋白的鉴定

3.不同GTP酶对SOS1-GEF活性的研究

SOS1 Ras GEF蛋白材料：

人类SOS1交换域（564-1049）蛋白（SOS1 ExD）已在细菌表达系统中产生。重组蛋白的氨基末端含有个6组氨酸标签（His标签）。SOS1 ExD蛋白的分子量约为61 kDa。蛋白质以冻干白色粉末的形式提供。

SOS1 Ras GEF 蛋白存储：

应通过添加33μl蒸馏水将蛋白质重组至50µM（3.03 mg/ml）。蛋白质将在以下缓冲液中：17 mM Tris pH 7.5、17 mM NaCl、0.2 mM MgCl2、2.3%蔗糖和0.3%右旋糖酐。为了保持蛋白质的高生物活性，强烈建议将蛋白质溶液分为“实验大小”的等份，并在液氮中快速冷冻。该蛋白质可在-70°C下储存6个月。避免反复的冻融循环。冻干蛋白质在4°C下干燥保存（湿度<10%）1年。

SOS1 Ras GEF 蛋白纯度：

蛋白质纯度通过在4-20%聚丙烯酰胺梯度凝胶上扫描考马斯蓝染色蛋白质的密度测定来确定。确定SOS1 ExD蛋白纯度>90%。

SOS1 Ras GEF 蛋白试剂：

1.重组Ras蛋白

2.重组SOS1 ExD蛋白（Cat.#GE02）

3.2倍交换缓冲液（40 mM Tris pH 7.5，100 mM NaCl，20 mM MgCl2，0.1 mg/ml BSA，1.5μM mant GTP）

4.稀释缓冲液（20 mM Tris pH 7.5，50 mM NaCl，10 mM MgCl2，0.1 mg/ml BSA）

SOS1 Ras GEF 蛋白方法：

1.用稀释缓冲液将SOS1 ExD蛋白（Cat#GE02）稀释至6μM（0.36 mg/ml）。

2.用稀释缓冲液将Ras稀释至50μM（1.1 mg/ml）。

3.将冻干的2x交换缓冲液溶解在5mL Milli-Q水中，并在室温下保存。

4.设置平板读取器进行动态荧光测量（激发波长为360 nm，发射波长为440 nm），每30读取次，持续30分钟。

5.加入以下成分，轻轻移液混合：

交换反应混合物/96孔黑板

2倍交换缓冲液/50μl

dH2O/36μl

50μM Ras/4μl

6.在各自的孔中移取10μl 6μM SOS1 ExD蛋白质或稀释缓冲液，立即上下移取两次，并开始读取荧光。

7.旦读数完成并保存了读板器文件，就可以使用读板器附带的软件将数据减少到Vmax来计算汇率。