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品名:双链RNA(dsRNA),ELISA试剂盒
同义词名称:dsRNA ELISA试剂盒
仅供研究使用。不适用于诊断程序。
克隆性:单克隆
同位素:小鼠IgG2a-kappa/IgM-kappa
克隆编号:J2/K2
物种反应性:全体的
艾美捷双链RNA定量试剂盒来源:
本试剂盒中使用的两种dsRNA抗体如下:雌性DBA/2小鼠腹腔注射50ug L-dsRNA和75ug甲基化牛血清白蛋白的混合物,在完全弗氏佐剂中乳化。在几次增强后,将脾细胞与Sp2/0-Agl4骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤克隆J2和K2。
该试剂盒包含以下试剂,用于200次测试(2x96孔):
试剂01:1小瓶包衣抗体(储存于-20℃
试剂A:1小瓶142 bp dsRNA作为阳性对照(储存于-20℃)
试剂B:1小瓶dsRNA特异性检测抗体(在RPMI+5%FBS中,储存在+4℃或好是-20℃)
试剂C:1小瓶HRP缀合的F(ab’)2山羊抗小鼠二抗体片段(储存于+4℃或-20℃)
试剂D:1小瓶TMB底物溶液(储存于+4℃,避光
艾美捷双链RNA定量试剂盒试验方案:
所需但未提供的材料和设备
2个ELISA板(96孔)
具有370 nm和450 nm双波长能力的微量板读数分光光度计。
单通道移液管-10ul和200ul
多通道移液管-200ul
抗原(标准和样品)稀释剂(STE缓冲液:0.1M NaCl、1mM EDTA、50mM Tris-HCl,pH7.0)
洗涤缓冲液(PBS+0.5%吐温20;PBS:10mM Pi缓冲液,pH7.2,0.15M NaCl)
二抗体稀释缓冲液(PBS+1%BSA)
培养箱,允许在37℃下培养。
2米硫酸氢
试剂和ELISA板的制备
通过加入4ul不含RNase的MilliQ水,重新配制试剂A。浓度为1ug/ul dsRNA。(储存于-20摄氏度或-80摄氏度)
使用DEPC处理过的MilliQ水制备STE(适用于您自己的样品制备)
通过高压灭菌灭菌PBS和STE
制备PBS+1%BSA和ELISA洗涤缓冲液
ELISA板涂层
将试剂01管的总含量转移到21 ml PBS中,充分混合并立即在2个ELISA板中分配100ul/孔。
盖上盘子,在4摄氏度下孵育过夜。
将井中的内容物丢弃到废物中。向每个孔中加入100ul/孔1%BSA在PBS+0.2%NaN3中的溶液,并在37℃下孵育2小时,以饱和板上任何剩余的自由结合位点。
丢弃溶液并用PBS+0.5%吐温20洗涤板3次。
然后可以直接使用或储存这些板。为了储存,用含0.2%叠氮化钠的200ul/孔PBS填充孔。将盘子用塑料箔包裹起来,在4摄氏度下冷藏保存。它们可以在一个月内保持活力。使用储存板时,必须用PBS彻底清洗,以去除所有痕量的NaN3。
1个板的分析方案:
所有标准品和样品应至少检测两份。
使用干净、无RNase的带盖微型离心管。
不要使用含有NaN3的缓冲液,因为它会干扰终检测步骤。
1.从试剂A制备1:3系列稀释液。dsRNA标准品的稀释系列应在样品的预期dsRNA浓度范围内。我们建议以30ng dsRNA/孔作为高浓度,并稀释至低于0.01ng dsRNA/孔。每次化验应新鲜稀释。
2.在STE中制备样品稀释液(必要时)。
3.盖上并旋涡所有稀释的标准品和样品。
4.从ELISA板上取下塑料箔,丢弃液体并用PBS+0.5%吐温20洗涤两次。
5.丢弃溶液并将100-100ul抗原转移到板中的重复孔中。
6.盖上盖子并在37℃下孵育60分钟。
7.将井中的内容物丢弃到废物中。用PBS+0.5%吐温20洗涤板4次,每孔加入250ul洗涤液。在加入下一种溶液之,不要让井变干。
8.用移液管将100ul未稀释试剂B移到所有孔中。
9.盖上盖子,在37℃下孵育60分钟。
10.在孵育(步骤9)期间,通过将1.4ul试剂C移液至10ml PBS+1%BSA
艾美捷双链RNA定量试剂盒原理:
基于使用两种双链 RNA (dsRNA) 特异性单克隆抗体,dsRNA 检测试剂盒可以灵敏和选择性地检测 dsRNA 分子(大于 30-40 bp),而不受其核苷酸组成和序列的影响。检测具有高度特异性:在存在 1.000-10.000 倍过量其他核酸的情况下,可以检测核酸提取物中的dsRNA。该测定基于双抗夹心ELISA原理,使用 J2 (IgG2a) 小鼠单克隆抗体作为捕获抗体,单克隆抗体 K2 (IgM) 用作检测抗体。
来源:https://www.amyjet.com/brand/double-stranded-dsrna.shtml
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