艾美捷Detroit R&D 生物靶标20-HETE-ELISA试剂盒使用方法

人类原发性和盐敏感性高血压与细胞色素P450的AA代谢差异有关（CYP）4A，具有AA-ω-羟化酶（20-HETE合成）活性。循环胰岛素增加抑制20-肥胖高血压受试者的HETE合成。 

近，CYP4F2基因变异增加了尿20-HETE的分泌，被发现与中国人群患高血压的风险。

该试剂盒可用于测定促渗后血清、血浆、细胞和组织中的20-HETE和纯化。

保存：如果所有组件在使用都储存在适当的温度下，该套件将获得较佳的效果。项目应在收到此试剂盒后在指定温度下储存。所有部件都储存在-20°C以下，并且不应在必要时再次冷冻和解冻。

艾美捷Detroit R&D 生物靶标20-HETE-ELISA试剂盒样品制备：

表达细胞色素P450（CYP）4A/4F的细胞中的20-HETE测量

1.使用含有终浓度的约0.1 mM TPP（三苯基膦，0.03-0.05 mg/mL）。TPP是一种抗氧化剂，看起来像沉淀在样品中，因为它不容易溶解。在使用包含TPP，旋转样品以从样品溶液中分离沉淀的TPP。

2.用乙酸将整个均化的细胞酸化至约3-4的pH。测量使用标准pH纸。

3.用乙酸乙酯萃取。向均质细胞中加入等体积的乙酸乙酯涡流非常好。离心后，将上层有机相放入新鲜干净的试管中。然后添加将另一等体积的乙酸乙酯加入均化细胞中，开始第二次提取。它是强烈建议进行三次提取。

4.从提取物中蒸发合并的乙酸乙酯，直到所有乙酸乙酯都在氩气或氮气下干燥气体

5.皂化（如需要）

6.加入20μL N，N-二甲基甲酰胺（DMF），使干燥的残留物溶解，用于重建。添加0.5 mL 1x样品稀释缓冲液（试剂盒中提供）制成溶液。在每个孔中加载100μL，以三份的形式在ELISA板上。（注意：我们建议在尝试将结果拟合到标准曲线。例如，用50μL的剩余样品加上3个孔50μL的1x样品稀释缓冲液，以及3个孔，其中10μL的其余样品加上90μL的1x

样品稀释缓冲液。）

7.对20-HETE进行ELISA（根据制造商的说明）。

组织中的20-HETE测量：

1.将1g组织、4mL H2O和0.01mg TPP均匀化。

2.通过向每个匀浆中加入8μL乙酸来酸化匀浆。

3.用等量的乙酸乙酯提取，彻底涡旋，向下旋转，收集有机物阶段再重复两次提取，将所有有机相合并。

4.用氩气或氮气干燥有机相。

5.皂化（如果需要）（参见细胞中的20-HETE测量）

6.用N，N-二甲基甲酰胺（DMF）溶解来自上述步骤#4的干燥残留物。（添加约20μL的DMF以重新构成干燥的残留物。）

7.用1x样品稀释缓冲液进一步稀释：加入约0.5 mL 1x样品稀释剂缓冲并在室温下以10000rpm离心5分钟。上清液将用于ELISA。

8. 对20-HETE进行ELISA（根据制造商的说明）

血浆或血清中20-HETE的测量以下是使用1.0mL液体的起始体积测量血浆或血清中20-HETE的方案。启动也可以使用低于1.0mL的体积（例如，用于小鼠研究），通过制作适当的对所有体积和稀释度进行比例调整。

Detroit R&D注于心血管疾病、癌症的研究，诊断和治疗域。涉及环境健康科学、高血压、乳腺癌和列腺癌相关研究域。艾美捷科技是Detroit R&D的中国代理商，为科研工作者提供优质的产品与服务。

来源：https://www.amyjet.com/news/Detroit-R-D-new.shtml