艾美捷中性粒细胞胞外捕获物（NET）检测的制备方法

肿瘤诱导中性粒细胞胞外陷阱（NETs）形成

起初研究者们认为，在多种刺激 (如病原微生物及其产物、手术压力、缺氧等) 下，会引发 NETs，而现在对多种肿瘤 (包括乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、食管胃腺癌和肺癌等) 的研究都证明了肿瘤能创造促进 NETs 释放的系统性微环境。

事实上，在没有其他任何刺激的情况下，肿瘤自身便能诱发 NETs 形成，从而促进转移进展。该作用可能部分归因于原发瘤精心制作的细胞因子。如肿瘤产生的粒细胞集落刺激因子 (G-CSF) 和白介素8 (IL-8)，能与 GROα 或 GROβ 相互配合，从而促使 NETs 形成。此外，肿瘤来源的外泌体能诱导 NETs 释放，而 NETs 也可以招募肿瘤来源的外泌体。

艾美捷中性粒细胞胞外捕获物（NET）检测#601010提供了一种不依赖于DNA的检测NET形成的方法，通过一种弹性酶的底物，来检测中性粒细胞弹性酶的酶活，从而反映NET的形成.

Cayman NETosis检测试剂盒为体外研究NETosis过程提供了一种简单快速的方法。值得注意的是，Cayman的NETosis检测试剂盒不依赖于NETs的DNA成分，因为DNA释放可以独立于NETosis发生。在该试剂盒中，用PMA或钙离子载体（均包括在内）刺激原代中性粒细胞释放NETs。如图1所示，未结合的中性粒细胞弹性蛋白酶在NET生成后被冲走。在通过S7核酸酶消化NET DNA之后，将含有中性粒细胞弹性蛋白酶的上清液添加到底物中，该底物被中性粒细胞弹性蛋白酶选择性切割以产生吸收405nm光的4-硝基苯胺产物。提供足够量的每种试剂来测试和分析多达80个单独的样品或24个一式两份的样品。

中性粒细胞胞外捕获物（NET）检测试剂制备：

1.NET测定缓冲液（试剂盒中未包含的基础培养基）将500 ml RPMI 1640基础细胞培养基（未提供）与5 g牛血清白蛋白测定试剂（试剂盒编号400086）和500 ul氯化钙（1M）测定试剂（溶剂盒编号400087）混合制备NET测定缓冲溶液。NET测定缓冲液不是用来杀菌的，也不需要在组织培养罩中制备或使用。在细胞刺激和添加核酸酶之，将NET测定缓冲溶液预热至37℃，以确保快速激活和随后的核酸酶活性。储存未使用的NET分析缓冲液、无菌过滤器、等分试样，并储存在-20℃。注意：血清中含有能消化NETS的DNASE，应避免使用。

2.PMA（1 mm）检测试剂-（项目编号400145）使用，将1 ul PMA（1MM）检测试剂添加到5 ml预热的NET检测缓冲液中，制成10X工作储备溶液注：PMA是一种潜在致癌物。处理此解决方案时，请穿戴适当的防护措施并谨慎使用。

3.A23187（25 MM）含量测定试剂-（项目编号400085）使用，将10 ul A23187【25 MM】含量测定试剂加入1 ml预热的净含量测定缓冲液中，制成10X工作储备溶液。

4.S7核酸酶测定试剂（项目编号601011对于一个24孔板，在使用立即在12 ml预热的NET测定缓冲液中稀释12 ul S7核酸酶检测试剂（供应量为15000 U/ml），制成15 U/ml工作溶液

5.NET含量测定中性粒细胞弹性蛋白酶底物（项目编号601013）小瓶中含有15 MM N-甲氧基琥珀酰-ala-la-pro-val对硝基苯胺，这是中性粒细胞弹性蛋白酶的底物。为了测定24个样品，一式两份，并使用标准曲线，将225 UI NET测定中性粒细胞弹性蛋白酶底物稀释到6.5 ml PBS中（1:30稀释）。

来源：https://www.amyjet.com/products/601010-1.shtml