ELISA试剂盒预实验设置

一、实验目的

ELISA试剂盒预实验是为了确保实验的准确性和可靠性,验证试剂盒的灵敏度和特异性,同时为正式实验提供参考。通过预实验,可以了解实验条件、操作流程和注意事项,为后续的实验提供指导和帮助。

二、实验原理

ELISA试剂盒是一种基于酶联吸附法的检测方法,通过将特异性抗体或抗原与酶结合,形成酶标抗体或抗原。当待测样本与酶标抗体或抗原发生特异性结合时,酶会催化底物生成有色产物,通过颜色变化来检测待测样本中的抗原或抗体。预实验则是通过调整实验条件,如温度、时间、浓度等,来验证试剂盒的 反应条件。

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三、实验步骤

1. 准备试剂和样本

按照试剂盒说明书准备所需的试剂和样本。确保试剂的质量和有效性,同时对样本进行适当的处理和稀释。

2. 设置实验条件

根据预实验的目的,设置不同的实验条件,如温度、时间、浓度等。一般而言,可以通过设置不同的温度、时间和浓度梯度来寻找 反应条件。

3. 实验操作

按照试剂盒说明书进行实验操作。在每个实验条件下,分别进行多次重复实验,以减少误差和提高实验的准确性。

4. 结果观察和记录

观察实验结果,记录每个条件下的吸光度值或颜色变化情况。通过比较不同条件下的结果,可以确定 反应条件。

四、实验结果分析

1. 确定 反应条件

通过对不同条件下的实验结果进行分析,可以确定 反应条件。这些条件包括温度、时间、浓度等。在 反应条件下,酶标抗体或抗原与待测样本中的抗原或抗体能够充分结合,生成的颜色变化 ,从而得到准确的检测结果。

2. 验证试剂盒的灵敏度和特异性

通过预实验,可以验证试剂盒的灵敏度和特异性。灵敏度是指试剂盒能够检测到的小抗原或抗体浓度;特异性则是指试剂盒只与特定的抗原或抗体结合,不与其他物质发生交叉反应。在预实验中,可以通过比较不同浓度的标准品或已知样本的检测结果,来评估试剂盒的灵敏度和特异性。

五、注意事项

1. 严格遵守实验操作规程,避免污染和交叉反应。
2. 在使用试剂盒时,要注意试剂的有效期和质量,避免使用过期或质量不佳的试剂。
3. 在实验过程中,要注意观察实验现象,及时记录和整理实验数据。
4. 在分析实验结果时,要结合试剂盒说明书和相关文献资料,进行科学合理的解释和评估。

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效果测定
测定内容包括酶和抗体活性、结合物中酶含量和IgG含量、酶与IgG摩尔比值以及结合率。
⑴ 酶与抗体的活性 常用琼脂扩散或电泳法,使抗原与抗体形成沉淀线,经PBS漂洗1天,再以蒸馏水浸泡1小时,将琼脂凝胶片浸于酶底物溶液中着色,如果出现应有的颜色反应,再用生理盐水浸泡,颜色仍然不褪,表示结合物既有酶的活性,也有抗体活性。良好的结合物在显色后,琼扩滴度应在1:16以上。另一个测定方法是用系列稀释的酶标抗体直接以ELISA方法进行方阵滴定,此法不仅可以测定标记效果,还可以确定酶标抗体的使用浓度。
⑵ 结合物的定量测定 一般是对结合物中的酶和IgG进行定量测定。常用紫外分光光度计于403nm和280nm进行测定,然后按下列公式计算:
酶量(mg/ml)=OD403×0.42
IgG量(mg/ml)=(OD280-OD403×0.4)×0.94×0.62
对于过碘酸钠氧化法制备的标记抗体量,按下列公式计算:
IgG量(mg/ml)=(OD280-OD403×0.34)×0.62
已知酶量和IgG量后,即可计算出标记抗体的摩尔(mol)比值。
HRP/IgG摩尔比值=HRP(mg/ml)/IgG(mg/ml)×4
结合物中酶总量=HRP(mg/ml)×结合物溶液量
结合物产率=结合物中酶总量/标记时加入的酶量×
用于ELISA的结合物的酶量为400(g/ml时效果一般,为500(g/ml时效果较好,达 1000(g/ml时效果 。mol.比值由于结合物中含的IgG并不完全可靠,所以不能作为主要参数。一般认为mol.比值为0.7时效果一般,1.0时效果较好,1.5-2.0时 。酶结合率为 7%时效果一般,为9%-10%较好,达30%以上时 。
ELISA方法的基本类型、用途及操作程序
根据ELISA所用的固相载体而区分为三大类型:一是采用聚苯乙烯微量板为载体的ELISA,即我们通常所指的ELISA(微量板ELISA);另一类是用硝酸纤维膜为载体的ELISA,称为斑点ELISA(Dot-ELISA);再一类是采用疏水性聚脂布作为载体的ELISA,称为布ELISA(C-ELISA)。在微量板ELISA中,又根据其性质不同分为间接ELISA、双抗体夹心ELISA、双夹心ELISA、竞争ELISA、阻断ELISA及抗体捕捉ELISA。
间接ELISA
本法主要用于检测抗体。以鸭(DVH)抗体的ELISA为例,间接ELISA的操作程序如下。
⑴ 材料
① 包被液、洗涤液、保温液、底物液、终止液;
② DVH包被抗原、酶标抗抗体、阴性及阳性DVH参考血清;待检鸭血清;
③ ELISA检测仪、加样器、聚苯乙烯微量板。
⑵ 方法步骤
① 加抗原包被 → 4℃过夜,洗涤三次、抛干
② 加待检血清 → 37℃ 2小时,洗涤三次、抛干
③ 加酶标抗体 → 37℃ 2小时,洗涤三次、抛干
④ 加底物液 → 37℃ 30分钟,加终止液
⑤ 用ELISA检测仪测定OD值,并计算出P/N比值。
⑶ 结果判定 已知阳性血清与已知阴性血清的比值(P/N)≥2.1,而且已知阳性血清的OD值≥0.4;在上述条件成立的情况下,如果待检血清与已知阴性血清的比值(P/N)≥2.1,而且待检血清的OD值≥0.4,则判为阳性,否则判为阴性。
双抗体夹心
本法主要用于检测大分子抗原。现以检测鸡病毒(IBDV)的双夹心抗体ELISA为例介绍本法的操作程序。
① 加抗体包被 → 4℃过夜,洗涤三次、抛干
② 加待检抗原 → 37℃ 30分钟,洗涤三次、抛干
③ 加酶标抗体 → 37℃ 30分钟,洗涤三次、抛干
④ 加底物液 → 37℃ 15分钟,加终止液
⑤ 用ELISA检测仪测定OD值。
双夹心ELISA
此法与双抗体夹心ELISA的主要区别在于:它是采用酶标抗抗体检查多种大分子抗原,它不仅不必标记每一种抗体,还可提高试验的敏感性。此法的基本程序为:
① 加抗体(Ab-1)包被 → 4℃过夜,洗涤三次、抛干
② 加待检抗原(Ag) → 37℃ 60分钟,洗涤三次、抛干
③ 加用非同种动物生产的特异性抗体(Ab-2)→ 37℃ 60分钟,洗涤三次、抛干
④ 加入酶标抗Ab-2抗体(AB-3)→ 37℃ 60分钟,洗涤三次、抛干
⑤ 加底物液 → 37℃ 20分钟,加终止液
⑥ 用ELISA检测仪测定OD值。
竞争ELISA
此法主要用于测定小分子抗原及半抗原,其原理类似于放射测定。其基本程序为:
① 抗体包被 → 4℃过夜,洗涤三次、抛干
② 加入待检抗原及一定量的酶标抗原(对照孔仅加酶标抗原)→ 37℃ 60分钟,洗涤三次、抛干
③ 加底物液 → 37℃ 20分钟,加终止液
④ 用ELISA检测仪测定OD值。
被结合的酶标抗原的量由酶催化底物反应产生有色产物的量来确定,如果待检溶液中抗原越多,被结合的标记抗原的量就越少,有色产物就减少,这样根据有色产物的变化就可求出未知抗原的量。此法的优点在于快速、特异性高、且可用于小分子抗原及半抗原的检测;其主要不足在于每种抗原都要进行酶标记,而且因为抗原的结构不同,还需应用不同的结合方法。此外,试验中应用酶标抗原的量较多。