黄曲霉毒素B1检测

黄曲霉毒素B1检测试剂

酶标免疫分析定量测定黄曲霉毒素B1试剂盒。德国公司R-Biopharm制造（中文翻译件仅供参考，以试剂盒内附的英文原件为准）

RIDASCREEN Aflatoxin B1 30/15（产品编号：R1211）

简介

    采用竞争酶标免疫法定量测定谷物，饲料，花生，干果及其它食品中的黄曲霉毒素B1。试剂盒中包括了所有检测用的试剂。该试剂盒有96个试验孔包括标准试验，如果进行定量分析，必须有微孔板酶标仪。

样品制备

谷物/饲料：粉碎，甲醇/水提取，过滤，稀释

时间要求：（以10个样品为例）

谷物/饲料………………………………….……大约30分钟

测试时间………………………………………….大约1小时

（与样品数量多少无关）

检测下限    1ppb

回收率      80-100%

交叉反应

Aflatoxin B1…………………………………………….100%

Aflatoxin G1…………………………………………..大约29%

Aflatoxin B2………………………………………….大约13%

Aflatoxin G2…………………………………………大约3.2%

Aflatoxin M1…………………………………………大约1.5%

1.  用途

Aflatoxin B1 30/15竞争酶标免疫法定量测定谷物，饲料中的黄曲霉毒素B1。

2.  概要

黄曲霉毒素主要是两种霉菌Aspergillus flavus 及 A.paraticus的二级代谢物。这些霉菌在湿热的环境和耕作土地上污染的植物产生。黄曲霉毒素B1属于自然最强烈的致癌物质。

黄曲霉毒素B1作为毒性最高的的分析物，它一般产生于玉米，花生，巴西坚果和棉花种子中。

鉴于这种霉菌毒素的毒性，欧洲国家做出了相近的限量，对黄曲霉毒素B1的限量为2ppb，对黄曲霉毒素总量的限量为4ppb。

使用RIDASCREEN Aflatoxin B1 30/15检测试剂盒，能够快速而准确的检测谷物，饲料和其他食品中的黄曲霉毒素B1。

3.   测定原理

测定的基础是抗原抗体反应。微孔板包被有针对黄曲霉毒素B1抗体的捕捉抗体。加入标准或样品溶液、黄曲霉毒素酶标记物和黄曲霉毒素抗体。游离黄曲霉毒素与黄曲霉毒素酶标记物竞争结合黄曲霉毒素抗体，同时黄曲霉毒素抗体与固定在板孔的捕捉抗体相连接。没有连接的酶标记物在洗涤步骤中被除去。将酶基质/发色剂加入到孔中并且孵育。结合的酶标记物将微红色的发色剂转化为蓝色的产物。加入反应停止液后使颜色产生由蓝色变成黄色。在450nm处测量，吸光值与样品中的浓度成反比。

4.  提供的试剂

每一个盒中的试剂足够进行96个测量（包括标准测定孔）

盒中的材料如下

1×96孔板（12条 X  8孔）包被有捕捉抗体

6×黄曲霉毒素B1标准液，1.3 ml/瓶

浓度为：0ppb，1ppb， 5ppb，10ppb，20ppb，50ppb

黄曲霉毒素B1的甲醇/水溶液

1×酶标记物（6ml）………………………………….红色帽

过氧化物酶标记物的黄曲霉毒素B1

1×黄曲霉B1抗体（6ml）……………………………黑色帽

1×基质/发色剂（10ml）……………………………..蓝色帽

1×反应停止液（14ml）...….…………………... ……黄色帽

为1N硫酸

1×洗涤缓冲液

为10Mm的磷酸缓冲液（pH7.4），包含0.05%的Tween20

*   样品的10倍稀释倍数已经考虑，因此，样品中黄曲霉B1的浓度可以直接在标准曲线读取。

5. 需要的材料但盒中不提供

5.1设备

－－－－微孔板酶标仪（450nm）定量分析用

－－－－100ml量筒

－－－－样品提取用玻璃器皿：漏斗、50ml容量瓶

－－－－粉碎机

－－－－振荡器

－－－－Whatman NO.1或相当的滤纸

－－－－50ul，100ul，1000ul微量加样器

5.2 试剂

－－－－甲醇

－－－－70%甲醇溶液：准备70%甲醇溶液，70ml甲醇与30ml蒸馏水混合。

－－－－蒸馏水或去离子水

6.  操作者应该注意之事项

－－－－标准液含有黄曲霉毒素B1，要特别小心，应戴手套，避免试剂接触皮肤

－－－－使用过的玻璃容器最好用pH7的次氯酸溶液（10%V/V）浸泡过夜

－－－－反应停止液为1N硫酸，避免接触皮肤

－－－－不要使用过了有效日期的试剂盒，稀释或搀杂使用会引起 

  灵敏度的降低

－－－－不要交换使用不同批号的盒中试剂

7.   储存条件

－－－－保存试剂盒于2-80C。不要冷冻

－－－－将不用的微孔板放进原锡箔袋中并且与提供的干燥剂一起重新密封

－－－－标准物质对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下

－－－－基质/发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下

8. 试剂变质的迹象

红的基质/发色试剂若显蓝色表明发色剂变质，应当弃之。

0标准的吸光度值小于0.6个单位 （A450nm<0.6）时，表示试剂可能变质。

9. 样品处理 

样品应当在阴凉避光之处保存

在分析前将代表性的样品粉碎，彻底混均

－－－－称取5g 粉碎的样品于适当容器中，加入25ml 70%甲醇溶液

－－－－强力振荡3分钟（用手或振荡器）

－－－－用Whatman NO.1或相当的滤纸进行过滤

－－－－取1ml滤液加入1ml蒸馏水稀释

－－－－取50ul稀释液用于试剂盒分析

*根据需要可以增加样品量，但甲醇溶液的量也应相应增加 （例如：样品10g+50ml 70%甲醇溶液）

注意

如果样品中黄曲酶毒素的浓度比预计的浓度高，样品需要进一步稀释。请注意加入到微孔中分析的样品必须是比例为35/65的甲醇/水溶液。

10.  酶标免疫分析程序

10.1测定之前注意事项

1. 用之前将所有试剂回升至室温（20-25℃）。

2. 使用之后立即将所有试剂放回2-8℃。 

3. 在使用中不要让微孔干燥。

4. 在EIA分析中的再现性，很大程度上取决于洗板的一致性，仔细按照推荐的洗板顺序操作是EIA测定程序中的要点。

5. 在所有恒温孵育过程中，避免光线照射，用盖子盖住微孔板。

10.2包被有抗体的微孔板条

锡箔袋沿横向边压封线外侧剪开。取出需用数量的微孔板及框架，将不用的微孔板放进原锡箔袋中并且与提供的干燥剂一起重新密封，保存于2-80C。不要冷冻.

10.3标准液

黄曲霉毒素B1标准液直接应用，样品的10倍稀释倍数已经被考虑，因此，样品的黄曲霉B1的浓度可以直接在标准曲线读取。

10.4  洗涤缓冲液

在试剂盒中提供一包洗涤缓冲液的粉剂，一包粉剂溶解于1升的蒸馏水中，制备好的洗涤缓冲液在4oC条件下保存4周。

方法二：

将小袋里粉剂只用100ml蒸馏水溶解得到一个10倍的缓冲液浓缩液。此溶液在室温（20-25°C）下，可保存8周。

使用时，1倍的浓缩液+9倍的蒸馏水稀释即可得到待用的洗涤缓冲液

10.5测定程序  （在20-25 oC条件下操作）

1．将足够标准和样品所用数量的孔条插入微孔架，标准及样品做平行，并记录标准及样品的位置。

2.加入50ul的标准或处理好的样品到各自的微孔中，每个标准和样品必须使用新的吸头。

3.加入50ul酶标记物（红色帽）到微孔底部。

4.加入50ul黄曲霉抗体（黑色帽）到微孔底部，轻轻地在桌面振摆酶标板，使之混合。在室温（20-25 oC）孵育30（+/-1）分钟

5.倒出孔中的液体，将微孔架倒置在吸水纸上拍打以保证完全除去孔中的液体。每孔注入250ul洗涤缓冲液。再次倒出孔中的液体，完全除去孔中的液体，重复操作洗涤步骤两次以上。

6.加入100ul基质/发色试剂（蓝色帽）到微孔中，充分混合并在室温暗处孵育15（+/-1）分钟。

7.加入100ul反应停止液到微孔中，混合好在450nm处测量吸光度值，以空气为空白，15分钟内读取光度值。

11.  结果

所获得的标准和样品吸光度值的平均值除以第一个标准 （0标准） 的吸光度值再乘以100。因此0标准等于100%并且以百分比给出吸光度值。

标准的吸光度值（或样品）

－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－x 100= %吸光度值

0标准的吸光度值

计算的标准值绘成为一个以黄曲霉毒素B1浓度（ng/kg）的半对数坐标系统曲线图，校正曲线在5-20ppb范围内应当成为线性，相对应每一个样品的浓度可以从标准曲线上读出。

12．  灵敏度

RIDASCREEN Aflatoxin B1 30/15试剂盒的最低检测下限为大约1ppb

13．  特异性

RIDASCREEN黄曲霉毒素B1试剂盒的特异性通过对相应的物质进行交叉反应性分析而得到：

Aflatoxin B1………………………………………..……100%

Aflatoxin G1…………………………………………大约29%

Aflatoxin B2………………………………………..大约13%

Aflatoxin G2……………….………………………...大约3.2%

Aflatoxin M1………….……………………….……..大约1.5%

14. 再现性

由三个不同的实验结果确定了室内精密度，图2显示出RIDASCREEN Aflatoxin B1 30/15试剂盒的精密度情况，获得的标准吸收值的变异系数（%CV）对相应黄曲霉毒素B1浓度作曲线，可以看到在全部范围内变异系数如此之低，可以得到很好的再现性。

15.  回收率

谷物类样品黄曲霉毒素B1的回收率80-100%，平均变异系数大约为8%

16.  参考文献

见试剂盒中提供的英文原版说明书。