T-2毒素快速检测试剂

酶联免疫分析快速定量测定T-2毒素试剂盒 （产品编号：R5302） 德国R-Biopharm制造 （中文翻译件仅供参考,以试剂盒内附的英文原件为准）

1.用途

    采用竞争性的酶免疫分析法定量分析谷物及饲料中的T-2毒素。试剂盒中含有酶免疫分析法所用的所有的试剂。试剂盒可以进行48个试验，包括标准。定量分析要求使用酶标板读数仪。

2.概要

     T-2毒素是由几种镰刀素菌属产生的，是人类营养中毒的白细胞缺乏症疾病的主要起因毒素,它对许多动物也有不力影响，由于T-2 毒素的毒性对于蛋白质合成的损害是很明显的。

    对禽类的研究表明 T-2毒素导致体重增长速度减慢及其他问题，如禽类嘴夹的损害，羽毛杂乱，控制肌肉生长的神经中枢损伤并且易受到沙门氏菌的感染。

    在许多其他动物中，一直有报到产生肠蠕动，呕吐 和改变线粒体。T-2毒素的存在伴随出现细胞和器官损坏的大面积的蔓延，包括：血液，肝脏，肾脏，胰腺肌肉及心脏的影响。T-2毒素引起的消化系统的损坏是不可逆转的。

    除了人类以外，动物也会受到T-2毒素的影响包括猪，乳牛，家禽，狗和马。在严重的情况下T-2 毒素可以引起死亡。

HPLC,TLC 及GC是检测T-2毒素常用的方法,但是这些方法制备样品费时又费力并且需要昂贵的仪器设备及很专业的技术培训，而使用RIDASCREEN FASTT-2毒素快速检测试剂盒则能够给你提供快速而准确的分析.

3． 测定原理

测定的基础是抗原抗体反应。微孔板包被有针对兔IgG的羊抗体。加入T-2 毒素抗体，酶标记物，标准或样品溶液。游离T-2 毒素素与酶标记物竞争T-2 毒素抗体，同时T-2 毒素抗体与羊抗体连接。没有连接的酶标记物在洗涤步骤中被除去。将酶基质（过氧化尿素）和发色剂（四甲基联苯胺）加入到孔中并且孵育。结合的酶标记物将无色的发色剂转化为蓝色的产物。加入反应停止液后使颜色由蓝转变为黄色。在450nm处测量，吸收光强度与样品中的浓度成反比。

4． 提供的试剂

每一个盒中的试剂足够进行43个测量（附加5个标准分析孔），盒中的材料如下：

1 X 48孔板（6条 X  8孔，可以拆分为单孔）包被有羊抗体

5 X 标准液, 1ml/瓶, 为T-2 毒素标准溶液

标准液浓度为：0ppb;  50ppb;  100ppb ;  200ppb;  400ppb

1 X  T-2 毒素抗体溶液（3ml）鼠单克隆，直接使用，黑色帽

1 X  酶标记的T-2 毒素，直接应用液（3ml）…….红色帽

1 X  基质/发色剂（6ml）……………………….…..白色滴瓶

1 X  反应停止液1M硫酸（6ml）...….……….…..黄色滴瓶

5． 需要的材料但盒中不提供

－－－－5.1设备

－－－－微孔板酶标仪（450nm）定量分析用

－－－－振荡器

－－－－粉碎机

－－－－50ul, 100ul, 1000ul微量加样器

－－－－100ml量筒

－－－－50ml 漏斗及容量瓶

－－－－WhatmanＮｏ１或相当的滤纸

5.2 试剂

－－－－甲醇，７０％甲醇溶液，蒸馏或去离子水。

6. 操作者应该注意之事项

－－－－标准液含有T-2 毒素，应特别小心

－－－－使用过的玻璃容器及T-2 毒素溶液最好用pH7的高

   氯酸溶液（10%V/V）浸泡过夜

－－－－反应停止液为1M硫酸,避免接触皮肤

－－－－不要使用过了有效日期的试剂盒, 稀释或搀杂使用会引起 

   灵敏度的降低.

－－－－不要交换使用不同批号的盒中试剂.

7. 储存条件

－－－－保存试剂盒于2-80C.不要冷冻

－－－－无色的发色剂对光敏感,因此要避免直接暴露在光线下

－－－－将不用的微孔板放进原 锡箔袋中并且与提供的干燥剂

  一起重新密封.

8. 试剂变质的迹象

发色试剂有任何颜色,表明发色剂变质,应当弃之. 0标准的吸光度值小于0.6个单位 （A450nm<0.6）时,表示试剂可能变质.

9. 样品处理 （样品应当在暗处及冷藏保存）

－－－－5g粉碎的样品与25ml甲醇70%溶液

－－－－振荡3分钟，

－－－－用Whatman No.1滤纸提取

－－－－用1ml蒸流水稀释1ml滤液

－－－－取50ul稀释液进行分析

*根据需要可以增加样品量，但甲醇溶液的量也应相应增加。

10. 酶标免疫分析程序

10.　1 　测定之前注意事项

1. 使用之前将所有试剂回升至室温.（18-24oC）

2. 使用之后立即将所有试剂放回2-8 oC.

3. 在使用中不要让微孔干燥

4. 在EIA分析中的再现性,很大程度上取决于洗板的一致性,仔细按照推荐的洗板顺序操作是EIA测定程序中的要点.

5. 在所有恒温孵育过程中,避免光线照射,用盖子盖住微孔板.

10．２　包被有抗体的微孔板条

锡箔袋沿横向压皱外边打开.取出需用数量的微孔板及框架, 将不用的微孔板放进原锡箔袋中并且与提供的干燥剂一起重新密封, 保存于2-80C.不要冷冻.

10.3标准液

   T-2 毒素标准液为直接应用液，已经考虑了样品制备的10倍稀释，因此样品中的T-2 毒素的浓度可以直接从标准曲线读出。

10.4测定程序,在18-24 oC条件下操作

1. 将足够标准和样品所用数量的孔条插入微孔架

2. 加入50ul的标准或处理好的样品到各自的微孔中，每个标准和样品必须使用新的吸头。

3. 加入50ul酶标记物到微孔底部, （红色盖）。（ 注意移液器管尖千万不要接触到放进孔中的液体，避免交叉污染。）

4. 加入50ul抗体溶液（黑色盖）到每一个微孔底部，充分混合，在室温孵育10分钟。（注意此操作步骤要快，尽量保持前后孔孵育时间的一致，如果实验所用孔数量多，请用多通道移液器。移液器管尖千万不要接触到放进孔中的液体。）

5. 倒出孔中的液体,将微孔架倒置在吸水纸上拍打以保证完全除去孔中的液体.用洗瓶或多通道移液器将250ul蒸馏水加入孔中。再次倒出孔中的液体,完全除去孔中的液体，再重复操作洗涤步骤两次以上。（移液器管尖千万不要接触到放进孔中的液体，避免污染洗涤液造成洗板不彻底。洗板后要立即进行下一步操作，避免板孔干躁造成重复性差）

6． 加入 2滴（或100ul）基质/发色试剂（白色滴瓶）到微孔

中, 充分混合并在室温  暗处孵育5分钟。（注意此操作步骤要快，尽量保持前后孔孵育时间的一致，如果实验所用孔数量多，请将所需数量的滴瓶中液体转移至V型试剂槽中注意避光，并用多通道移液器加液。移液器管尖千万不要接触到放进孔中的液体。）

7． 加入 2滴（或100ul）反应停止液（黄色滴瓶）到微孔中混合好, （注意此操作步骤要快，如果实验所用孔数量多，请将所需数量的滴瓶中液体转移至V型试剂槽中，并用多通道移液器加液。）在450nm处测量吸光度值以空气为空白,必须在加入停止液后10分钟内读取光度值.

11. 结果

定量分析：所获得的标准和样品吸光度值除以第一个标准（0标准）的吸光度值再乘以100.因此0标准等于100%并且以百分比给出吸光度值.

标准的吸光度值（或样品）

－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－x 100=   %吸光度值

0标准的吸光度值

计算的标准值绘成为一个对应T-2 毒素浓度（ug/kg）的半对数坐标系统曲线图, 相对应每一个样品的浓度（ug/kg）可以从标准曲线上读出.

RIDASCREEN FAST T-2毒素标准曲线见英文原版说明书

仪器半定量测定：首先选择一个适当的标准液与样品同运行，根据样品与标准吸光度值的高低比较，判断样品浓度值是小于（吸光度高）还是大于（吸光度低）标准值。

目测半定量测定：首先选择一个适当的标准液与样品同运行，根据样品与标准颜色深浅比较，判断样品浓度值是小于（颜色深）还是大于（颜色浅）标准值。特别注意如果选择50ppb 或100ppb 的标准，请在步骤6中将在室温暗处孵育5分钟 更改为2-3分钟。

12．灵敏度

检测下限小于20ppb，此时的吸光度值明显不同于0标准的吸光度值。定量检测下限为50ug/kg（50ppb）。

12．1 检测限

检测限为20ppb，（通过对不含T-2 毒素的谷物及混合饲料的多次重复测定，平均吸光度+3倍的标准偏差为检测下限，所有结果均在10-20ppb之间。）

12．2 定量检测限

通过添加实验发现定量检测下限为50 ppb，此时的回收率为70%-110%，CV值小于20%

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