标题植物病原真菌的分离培养

一、实验原理
植物患病组织内的真菌菌丝体，如果给予适宜的环境条件，除个别种类外，一般都能恢复生长和繁殖。植物病原菌的分离就是指通过人工培养，从染病植物组织中将病原真菌与其它杂菌相分开，并从寄主植物中分离出来，再将分离到的病原菌于适宜环境内纯化，这个过程总称植物病菌的分离培养。植物病原真菌的分离一般都是采用组织分离法，就是切取小块病组织，经表面消毒和灭菌水洗过后，移到人工培养基上培养。

二、实验目的植物病原菌的分离培养是植物病理学实验最基本的操作技术之一，它对原害鉴定，病原形态观察、植物病害接种体的培养等方面都是经常使用的研究手段。通过本实验，要求植物病原菌分离培养的一般原则和方法。

三、实验材料及准备
1．分离材料：梨黑斑病（Alternaria kikuchiana），柿树圆斑病（Pestnlotia sp）及杉木炭疽病（Glomerella cingolata）新发病的病叶；杨树烂皮病（Cytospora chrysosperma）国槐腐烂病（Dothiorella sp.）的带有新病斑的枝条；油松种子。
2．分离用具（每小组为单位）酒精灯4个，手术剪4把，眼科镊4把，PDA培养基3瓶，培养皿（Φ9cm）24套，小烧杯（5ml）4个，大烧杯1个，斜面培养基12管，灭菌水4瓶，75%酒精瓶1个（内放脱脂棉球）0.1%升汞瓶1个，5%乳酸瓶（60ml）1个，火柴1盒，湿、干纱布各4张。
四、实验方法及步骤
（一）分离前的准备工作
1．工作环境的清洁和消毒分离培养一般在无菌室、无菌箱或无菌工作台（超净工作台）上进行，无菌室和无菌箱要经过喷雾除尘，并用药物或紫外线照射消毒（常用消毒药物为70%酒精，2%煤酚皂液，5%石炭酸液等喷雾。若用紫外线灯照射则需20-30分钟）。在没有上述设备条件时，在清洁房间里关闭门窗，避免空气流动，经过喷雾除去空气及地面灰尘后进行操作，也可获得较好的结果。工作前擦净桌面，最好铺上湿纱布。将所需用的物品按次序放在工作台上，避免工作时走动，工作人员最好穿上灭菌后的工作服，带上口罩，并用肥皂洗手，用70%酒精或0.1%新洁尔灭擦手。
2．分离用具的消毒凡是和分离材料接触的器皿（刀、剪、镊、针等）都要随时（至少在使用时）保持无菌，将这些用具浸于70%酒精中，使用时在灯焰上灭菌烧去酒精，如此2-3次（刀、剪、镊等不宜在灯焰上烧时过长，以防退火）。再次使用时必须重复灭菌。培养皿、试验等要经过干热灭菌。培养基及洗涤或稀释用蒸馏水都需要事先经过高压蒸气灭菌。
3．分离材料的选择用新发病的植株、器官或组织做为分离材料，可以减少腐生菌的污染。任何植物坏死部分的内部或表面，都可能有腐生微生物的孽生，所以一般斑点病害应从邻近健全组织，即从病、健组织交界处获得分离材料。

（二）植物病原菌的分离
1．叶斑类和枝杆病斑类（非维管束侵染）病原菌分离首先选择具有典型症状的新鲜病叶作为分离材料，
按下述步骤操作：①培养基平板制备：将PDA培养基在微波炉中加热熔化验，以无菌操作法将溶化过的培养基倾注入灭过菌的培养基中，每皿经12毫升，可形成2-3毫米厚的平板。（为防止细菌污染，倒碟前给每三角瓶内加6%乳酸4-6滴）。
②病叶或病枝经自来水冲洗，从病斑周转1-2毫米处的健组织部位剪下（若为枝干，则将带有病斑的皮层剥下，但）。
③取10毫升小烧杯经酒带消毒，放入分离材料，倒入0.1%升汞液适量作表面消毒一分钟，或用1%漂白粉消毒均可。
④消毒后倾出消毒液，用无菌水冲洗2——3，最后一次无菌水不要倒掉。
⑤用灭菌镊，剪在无菌水中将分离材料剪成2——3毫米大小的方块，每块组织均应为病健相间组织。用灭菌镊子夹取剪好的材料，放入培养基平板上，轻轻按压。每皿4——5块，排放均匀。
⑥用蜡笔在培养皿上注明分离代号，日期、姓名，将培养皿翻转放置于23—25℃⑦3-4日后挑选由分离材料上长出的典型而无杂菌的菌落，在菌落边缘用移菌针挑取带有菌丝的培养基一小块，转入试管斜面培养基中央，于25℃温箱中培养。

2．种子内病菌的分离将整粒种子或种子的一部分进行冲洗，再经表面消毒（升汞或漂白粉），最后用灭菌水洗涤后移到人工培养基平板上培养（或者直接放在皿内保湿培养于25℃温箱中）。
3．危害输导组织病原的分离（以枯萎病为代表）先将分离茎作表面消毒，然后用灭菌刀剥去表皮，剪取其中小块变色的维管束组织，再用漂白粉进行表现消毒后，移于培养基平面上培养。
4．分离物的纯化前述方法获得分离物，必须经过纯化，才能成为培养，纯化的方法有单孢子分离法和边续稀释培养法两种，后者简便，为了一般研究所常用。连续稀释法：对真菌材料来说，就是从典型菌落边缘切取含有菌丝的培养基一小块，移植于另一培养基平板上，待菌落形成后，再依此法移植。如此数次，直至菌落形态典型，无杂菌时即可移入斜面试管中培养保存。
附：1、0.1%升汞液的配制：升汞1克，浓盐酸2.5毫升；加水1000毫升。注意要先将升汞用盐酸溶解，然后加水稀释。
2、P.D.A培养基成分；马铃薯200克，葡萄糖10-20克，洋菜17-20克，水1000毫升。3、水洋菜培养基成分，洋菜17-20克，水1000毫升。