无论使用哪种固定方法，抗体结合及检测的步骤基本相同。其方法学及理论与其他组织来源的染色均相似。在鉴定和证实阳性反应方面应注意交叉反应。在前述组织切片染色部分已讨论关于抗体选择和对抗原正确定位的方法。对于在虫体中进行抗原免疫定位的一个主要优点是可检测一个无效基因。如果可能的话，它对某些动物染色是非常有用的，这些动物可以携带一个突变基因或用RNAi处理过的，以抑制所研究抗原的合成。这样会提供一个有用的对照，从而证实一种染色模式。显然，在某些情况下，如基因功能的缺失是致命的，这种对照将是不可能的。
对于虫体免疫染色来说，最常用的方法是应用荧光染料标记的试剂。在对虫体的抗原进行研究中常常不使用酶标的二级试剂。其原因主要在于荧光染料对于抗原定位具有高度分辨力。
1．背景问题
影响虫体染色的一个重要因素是由于特异性和非特异性的交叉反应所造成的较高背景。除了在检测复杂组织的抗原时所遇到的问题外，虫体染色尚有一些特殊的问题。
第一个问题是通过强烈固定和透化处理方法可破坏许多抗原表位，增加了交叉反应发生的可能性。故需要使用多种抗体，并从中发现一种最适合于所检测抗原的抗体。
虫体免疫染色所涉及的另一问题是多克隆抗体的使用。多克隆抗血清几乎均含有抗细菌的抗体，这些细菌存在于产生抗体的宿主动物体内。通常存在于肠道和皮肤，或在抗感染过程中形成。因为虫体通常以细菌，如大肠埃希菌为食，这些抗体会混淆染色模式。如有可能，应使用单克隆抗体以代替多克隆抗体。如果使用多克隆抗体，可以采用两种策略：①所需的抗体可以通过抗原亲和柱纯化；②不是所需的抗体可以通过使用丙酮干燥脏粉预吸收去除。
2．虫体的复染
在应用免疫荧光技术检测虫体，复染是必要的。复染还可用以鉴定抗原在细胞中的确切位置。可采用两种通常的方法：①使用一种对核酸特异的荧光染料标记所有的细胞，通常DAPI适用于落射式荧光显微镜，碘化丙酮（P1）适用于共聚焦显微镜。将这些染料加到洗涤缓冲液中即可；②利用受组织特异启动子驱使的GFP。将这些基因插入到表达载体中，通过其表达来鉴定细胞。正常情况下使用GFP表达，或者使用GFP抗体（可购买）。
3．对照
特异性染色反应需要与对照进行比较。为了准确评价染色模式，应对来自同一种属的两种抗体进行比较。对于多克隆抗体，最好的对照是事先从制备特异性抗体的同一动物免疫前采集的血清，但也可以使用来自相同种属的非免疫动物的血清。对于单克隆抗体而言，对照应该与特异性抗体的来源相同；例如，细胞培养上清对比上清，小鼠腹水对比腹水，纯化抗体对比纯化抗体。对照抗体应该与特异性抗体的类和亚类相同。来自亲代骨髓瘤的细胞培养上清不适合作为对照，因为其中并不包含抗体。适宜的对照杂交瘤细胞株可从ATCC或欧洲动物细胞培养保藏中心获得。此外，应该检测二级试剂。在可能的情况下，同时对携带所研究抗原基因缺失的虫体进行染色。这将为特异性抗体提供一个极好的遗传对照。
