标题高效液相色谱法测定荜茇止痛酊中胡椒碱的含量

 【摘要】目的建立荜茇止痛酊中胡椒碱的含量测定方法。方法采用高效液相色谱法,C18色谱柱,四氢呋喃-甲醇-水（V∶V∶V＝30∶30∶50）为流动相,流速为1.0mL/min,柱温为室温,检测波长为343nm,进样10μL,以外标法计算含量。结果胡椒碱在8.3～41.5mg/L内峰面积与对照品质量浓度呈良好线性关系,其回归方程为：A＝3413186ρ－
　　
　　7467.7,r＝0.9998；其平均回收率为99.7%,RSD＝1.8%（n＝6）。结论该方法简便,重复性好,空白无干扰,可有效地控制荜茇止痛酊制剂的质量。
　　
　　【关键词】荜茇止痛酊；胡椒碱；高效液相色谱法
　　
　　Abstract：ObjectiveToestablishthemethodofcontentdeterminationofPiperineinBibaZhitongTincture.MethodsHPLCwasadoptedindeterminingthecontentofpiperineinBibaZhitongTincture.C18chromatographiccolumnwasusedwiththecolumntemperaturebeingtheroomtemperature.Themobilephasewastetrahydrofuran-methanol-water（V∶V∶V＝30∶30∶50）withthevelocityof1.0mL/min.Thedetectionwavelengthwas343nm,andthesamplingvolumewas10μL.Externalstandardmethodwaschosenforcontentcalculation.ResultsTheinnerpeakareaofpiperine（8.3～41.5mg/L）showedfinelinearrelationwithmassconcentrationofcontrolgroup.ItsregressionequationwasA＝3413186ρ－7467.7,r＝0.9998,withtheaveragerecoveryrationbeing99.7%,andRSD＝1.8%（n＝6）.ConclusionThemethodissimple,convenient,goodreproducibilityandnon-interference,andcaneffectivelycontrolthequalityofthepreparation.
　　
　　Keywords：BibaZhitongTincture；Piperine；HPLC
　　
　　荜茇止痛酊由荜茇、细辛和花椒等6味中药组成,具有祛风散寒止痛的功效,临床用于治疗风寒牙痛。本制剂生产采用提取挥发油,水煮醇沉等工艺加工制成。荜茇为方中君药,其主要有效成分为胡椒碱,2005版《中华人民共和国药典》（一部）采用内标法测定荜茇中胡椒碱的含量[1],文献报道胡椒碱的含量测定方法有高效液相色谱法[2-4]。本试验采用改进四氢呋喃-甲醇-水系统为流动相,外标法测定胡椒碱的含量,较适用于本中药复方制剂复杂成分的分离,有效控制荜茇止痛酊的质量。
　　
　　1仪器与试药
　　
　　高效液相色谱仪（日本岛津）LC-6A,包括：SPD-6AV检测器,C-R4A数据处理机。胡椒碱（批号0775-9702,由中国药品生物制品检定所提供,纯度为98.79%）；荜茇止痛酊（批号041212、041216、041220,无锡山禾药业股份有限公司生产）。甲醇、乙腈为色谱醇,无水乙醇为分析醇,水为熏蒸水。
　　
　　2方法与结果
　　
　　2.1色谱条件
　　
　　色谱柱：C18柱（4.6mm×250mm,10μm）,大连依科特科学仪器有限公司；流动相：四氢呋喃-甲醇-水（V∶V∶V＝30∶30∶50）；流速：1.0mL/min；检测波长：343nm；柱温：室温；分离度：R>1.5；理论板数按胡椒碱峰计算应大于1500。
　　
　　2.2检测波长的选择
　　
　　对胡椒碱的乙醇溶液进行紫外区扫描,结果胡椒碱在343nm处有最大吸收,故选用343nm作为检测波长。
　　
　　2.3流动相的选择
　　
　　曾试验4种流动相：①甲醇-水（77∶23）；②乙腈-水（70∶30）；③乙腈-0.05mol/L磷酸二氢钠溶液（70∶30）,用磷酸调节pH为3.5、3.1；④四氢呋喃-甲醇-水（30∶30∶50）,其中④使胡椒碱峰与杂质峰分离效果好,能基线分离。
　　
　　2.4溶液的制备
　　
　　对照品溶液的制备：精密称取胡椒碱对照品10mg,置50mL棕色量瓶中,加乙醇稀释至刻度,摇匀。精密量取5mL,置50mL棕色量瓶中,加乙醇稀释至刻度,摇匀,即得（每1mL中含胡椒碱20μg）。
　　
　　供试品溶液的制备：精密量取荜茇止痛酊1mL,置25mL棕色量瓶中,加无水乙醇稀释至刻度,摇匀,于冰箱中冷藏1.5h,取出,放置至室温,滤过,取续滤液5mL,置25mL棕色量瓶中,加乙醇稀释至刻度,摇匀,即得。
　　
　　阴性对照液的制备：按处方中药味的比例自配不含荜茇的群药,按其工艺制成阴性制剂,再按供试品溶液制备方法制成空白溶液,即得。
　　
　　2.5阴性液干扰试验
　　
　　精密吸取供试品溶液、阴性液和对照品溶液各10μL注入色谱仪中,由色谱图可知,在与对照品色谱峰保留时间相应的位置上,供试品溶液具有相同保留时间的色谱峰出现；而阴性液在此峰位无吸收,对本品中胡椒碱的含量测定无干扰,色谱图见图1。
　　
　　2.6线性关系的考察
　　
　　精密吸取胡椒碱对照品（10.38mg→50mL）1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL,分别置25mL棕色量瓶中,加乙醇稀释至刻度,摇匀,分别精密吸取10μL,注入高效液相色谱仪,记录峰面积。以对照品的含量对峰面积值作图,得到一个通过原点的直线,并绘制标准曲线。结果表明,胡椒碱在8.3～41.5mg/L范围内峰面积与对照品质量浓度呈良好线性关系,其回归方程为：A＝3413186ρ－7467.7,r＝0.9998。
　　
　　2.7精密度试验
　　
　　精密吸取同一供试品溶液（批号041212）,重复进样5次,求得RSD＝0.93%。
　　
　　2.8稳定性试验
　　
　　精密吸取同一供试品溶液（批号041212）,分别于配制后0、2、4、8、16、24h测定色谱峰面积,计算RSD为1.2%,结果表明,其在24h内基本稳定。
　　
　　2.9回收率试验
　　
　　精密吸取已知含量的同一批号（批号041212）样品0.5mL,分别精密加入胡椒碱对照品乙醇溶液,依法测定,结果平均回收率为99.97%,RSD＝1.8%（n＝6）。见表1。表1加样回收率试验结果（略）
　　
　　2.10样品中胡椒碱含量测定
　　
　　取3批荜茇止痛酊样品,照“2.4”项测定,结果见表2。表2样品含量测定结果（略）
　　
　　3讨论
　　
　　本实验采用高效液相色谱法内标法和外标法2种方法进行荜茇药材中胡椒碱含量的对比试验,结果显示,2种方法测定结果基本相同。2005年版《中华人民共和国药典》采用内标法测定含量,结果准确,但鉴于中药复方制剂成分复杂,采用内标法时分离度难以满足要求,因此,本实验研究采用外标法更为实际、可行。
　　
　　由于荜茇止痛酊所含成分复杂,给含量测定带来一定的困难。我们在样品前处理采用无水乙醇稀释、冰箱中静置除去杂质的方法,使样品得到净化,可满足含量测定的要求,且重现性好。