标题重庆道地药材青蒿高效液相色谱指纹图谱研究

  【摘要】目的建立重庆道地药材青蒿高效液相色谱（HPLC）指纹图谱研究方法。方法采用反相高效液相色谱法，测定青蒿药材指纹图谱，色谱条件为：色谱柱：ShimadzuC18（150mm×4.6mm，5μm）；流动相：甲醇-水梯度洗脱；流速：1.0ml·min-1；检测波长：206nm；柱温：25℃。结果建立了重庆道地药材青蒿指纹图谱标准。结论该指纹图谱方法简便、快速、重现性好，可作为青蒿药材的一项质控指标。
　　
　　【关键词】青蒿指纹图谱模糊模式识别高效液相色谱
　　
　　Abstract：ObjectiveToestablishanHPLCfingerprintanalysismethodforidentificationofArtemisiaannuaL.fromChongqing.MethodsThefingerprintwasdeterminedbyHPLC.TheanalysiswascarriedoutonShimadzuC18column（150mm×4.6mm,5μm）.ThemobilephasewasCH3OH-H2O（gradientelution）withaflowrateof1.0ml·min-1at206nmandtheseperationwasperformedat25℃．ResultsThestandardoffingerprintinArtemisiaannuaLwasestablished.ConclusionThemethodissimple,fastandrepeatable.ItcanbeusedinqualityassessmentofArtemisiaannuaL.
　　
　　Keywords：ArtemisiaannuaL；Fingerprint；Fuzzypatternrecognition；HPLC
　　
　　青蒿为菊科植物黄花蒿ArtemisiaannuaL.的地上部分,味苦、微辛，性寒。具有清热、解暑作用。用于瘟病、暑热、骨蒸劳热、疟疾、痢疾、疮痒等［1］。生于旷野、山坡、河岸，分布于全国各地，是重庆道地药材之一。本实验利用HPLC法建立了以青蒿素为参照峰的重庆道地药材指纹图谱，利用模糊模式识别软件计算各批药材相似度，为建立符合规模化生产的青蒿药材基地提供更多的科学依据。
　　
　　1仪器与试药
　　
　　Waters液相色谱仪（Waters1525泵、Waters2487紫外检测器）；SK2200LH超声仪（昆山市超声仪器公司）；H·S·G-IIC-4电热恒温水浴锅（上海仪表供销公司）；METTLERAE240电子分析天平。
　　
　　甲醇（色谱纯）；乙醇（药用）；其他试剂均为市售分析纯；水为纯净水，青蒿素对照品（批号0202-9501，供含量测定用）由中国生物制品检定所提供。
　　
　　共收集青蒿药材样品15批，均为重庆酉阳栽培品种，经本校傅善权副教授鉴定为黄花蒿ArtemisiaannuaL.的地上部分。
　　
　　2方法与结果
　　
　　2.1对照品溶液的制备取青蒿素对照品适量，用甲醇溶解制成1.10mg·ml-1的对照溶液，作为参照物。
　　
　　2.2供试品溶液的制备称取青蒿药材10g，加50ml乙醇回流提取3h，滤过，再加25ml乙醇同法处理两次，滤过，合并滤液，减压浓缩至无乙醇，加入相同体积的醋酸乙酯萃取3次，合并萃取液，浓缩至干，各取一定量，制成2.5mg·ml-1的溶液，0.45μm滤膜滤过，作为供试品溶液。
　　
　　2.3色谱条件参考文献［2，3］并经筛选确定其色谱条件为色谱柱：ShimadzuC18（150mm×4.6mm，5μm）；流动相：甲醇（A）-水（B）梯度洗脱（见表1）；流速：1.0ml·min-1；检测波长206nm；柱温：25℃，青蒿色谱图见图1。
　　
　　表1流动相梯度洗脱程序（略）
　　
　　图1青蒿素参照物与青蒿药材HPLC图（略）
　　
　　2.4方法学考察与结果
　　
　　2.4.1稳定性实验取“2.2”项供试样品溶液，在上述色谱条件下，分别于0，2，4，8，16h进样10μl，记录指纹图谱。各共有峰的保留时间的RSD为1.08%～2.71%，百分面积RSD为1.15%～2.82%，百分高度RSD为1.13%～2.94%，符合中药指纹图谱研究的技术要求，结果表明样品溶液在16h内稳定。
　　
　　2.4.2精密度实验取“2.2”项供试样品溶液，在上述色谱条件下，连续进样5次，记录指纹图谱。结果表明，各共有峰的保留时间的RSD为1.51%～2.91%，百分面积的RSD为1.94%～2.89%，百分高度的RSD为1.47%～2.98%，符合中药指纹图谱研究的技术要求，表明该仪器精密度较好。
　　
　　2.4.3重现性实验取供试样品6份，按“2.2”项供试样品溶液制备方法制得供试样品溶液。在上述色谱条件下，分别进样10μl，记录指纹图谱。结果表明，各共有峰的保留时间RSD为1.23%～2.82%，百分面积RSD为1.02%～2.78%，百分高度RSD为0.98％～2.97％，符合中药指纹图谱研究的技术要求，表明样品重复性较好。
　　
　　2.4.4青蒿样品指纹图谱模式标准的建立分别取10批不同批号的青蒿药材，按供试品制备方法制备，在上述色谱条件下各进样10μl，记录色谱图。经比较10批样品的色谱图，其中有11个峰为共有指纹峰。选择相对保留时间、相对峰面积、相对峰高为特征参数，计算各特征参数平均值，建立指纹图谱模式标准，见表2。
　　
　　表210批青蒿药材指纹图谱模式标准（略）
　　
　　2.4.5样品测定与相似度计算取5批样品,在相同色谱条件下测定，采用广义夹角余弦［4］，计算样品各共有色谱峰与标准模式中对应的色谱峰的相似度。结果各指纹图谱的相似度均大于0.9，即各批样品与所建立的模式标准有较好的相似性（见表3）。
　　
　　3讨论
　　
　　本实验对供试品溶液的制备方法、色谱条件进行了筛选。通过对不同提取溶剂、提取方法进行比较，以文中供试品的制备方法，所得指纹图谱峰数较多。以甲醇-水梯度洗脱分离效果较好，能使样品中各色谱峰较好地分离且出峰较多。对青蒿素的测定，大多采用衍生化方法，本文采用190～400nm波长扫描确定其最大吸收波长为206nm，避免了衍生化方法的繁琐，使样品处理更方便、快捷。
　　
　　采用相对保留时间、相对峰面积、相对峰高等定量表征参数对指纹图谱进行分析，以10批不同批次药材制定了青蒿药材指纹图谱模式标准。在此基础上，采用模糊模式识别方法评价5批样品各共有峰的相似度均大于0.9，符合中药指纹图谱研究的技术要求。
　　
　　表35批样品相似度计算结果（略）
　　
　　该方法具有稳定、重复性好的特点，是一种理想的指纹图谱分析方法，可作为青蒿药材的质控指标。