标题高效液相色谱法测定狼疮灵颗粒中芍药苷的含量

【摘要】目的建立狼疮灵颗粒中芍药苷的含量测定方法。方法采用高效液相色谱法,色谱柱：HypersilODS-2（150mm×4.6mm,5.0μm）；流动相：乙腈-0.4%的磷酸水溶液（10∶90）；检测波长：230nm；流速：1.0mL/min,柱温：25℃。结果芍药苷在0.608～3.04μg范围内呈良好的线性关系（r＝0.9999）,加样回收率97.77%,RSD＝0.62%（n＝5）。结论该方法快速可行、简捷准确、重复性好、结果可靠,可用于控制狼疮灵颗粒的质量。
　　
　　【关键词】狼疮灵颗粒；芍药苷；高效液相色谱法；含量测定
　　
　　Abstract：ObjectiveToestablishanaccuratemethodfordeterminationofpaeoniflorininLangchuagnlingGranules.MethodsHypersilODS-2（4.6mm×150mm,5.0μm）inanovenat25℃wasneed,withamobilephaseconsistingofacetonitril-0.4%granolitetreatment（10∶90）andUVdetectorat230nm,theflowratewas1.0mL/min.ResultThelinearrangeofpaeoniflorinwaswithin0.608～3.04μg（r＝0.9999）.Theaveragerecoverywas97.77%andRSDwas0.62%（n＝5）.ConclusionThemethodissimpleandaccurate.ItcanbeusedforthequalitycontrolofLangchuagnlingGranules.
　　
　　Keywords：LangchuanglingGranules；paeoniflorin；HPLC；contentdetermination
　　
　　狼疮灵颗粒主要是由赤芍、牡丹皮、生地黄、忍冬藤等中药组成的医院复方制剂,具有凉血散瘀、清热解毒之功效。方中芍药苷为主要有效成分,具有浓度和机能依赖性的双向免疫调节作用,临床主要用于治疗系统性红斑狼疮。本研究采用高效液相色谱（HPLC）法对狼疮灵颗粒中芍药苷进行含量测定,建立芍药苷含量的HPLC测定方法[1-2]。
　　
　　1仪器与试药
　　
　　Agilent1100型高效液相色谱仪,MettlerToledoAG135型电子分析天平（瑞士Mettler公司）,SCQ-250型超声波提取仪（上海申波超声公司）。芍药苷对照品（中国药品生物制品检定所提供,批号110736-200732）；狼疮灵颗粒（成都中医药大学附属医院提供,批号100315、100318、100322、100329,规格为15g/袋）。乙腈为色谱纯,水为纯净水,其他试剂均为分析纯。
　　
　　2方法与结果
　　
　　2.1色谱条件
　　
　　色谱柱：HypersilODS-2（4.6mm×150mm,5.0μm,依利特公司）；流动相：乙腈-0.4%的磷酸水溶液（10∶90）；检测波长：230nm；流速1.0mL/min；柱温：25℃；进样量：10μL。
　　
　　2.2溶液制备
　　
　　2.2.1对照品溶液的制备精密称取芍药苷对照品3.04mg,置10mL量瓶中,加甲醇溶解并定容至刻度,摇匀,即得对照品溶液（1mL含芍药苷0.304mg）。
　　
　　2.2.2供试品溶液的制备取本品0.5g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入甲醇50mL,摇匀,称定重量,超声处理（功率300W,频率40kHz）20min,放冷至室温[3],再称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。
　　
　　2.2.3阴性对照品溶液的制备按狼疮灵颗粒制备工艺制得缺少赤芍的阴性样品制剂,再按“2.2.2”项下方法制得阴性对照品溶液。
　　
　　2.3线性关系考察
　　
　　取上述对照品溶液,分别自动进样2、4、6、8、10μL。以芍药苷峰面积积分值为纵坐标,以芍药苷对照品的进样量（μg）为横坐标,绘制标准曲线。得回归方程为：Y＝1427.68X＋5.96,r＝0.9999。结果表明,进样量在0.608～3.04μg范围内线性关系良好。
　　
　　2.4专属性试验
　　
　　精密吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照品溶液各10μL,按上述色谱条件测定。结果在芍药苷出峰位置无干扰峰（见图1）。
　　
　　A
　　
　　B
　　
　　C
　　
　　注：A.对照品；B.供试品；C.阴性对照品
　　
　　图1狼疮灵颗粒HPLC图谱
　　
　　2.5精密度试验
　　
　　精密吸取对照品溶液10μL,重复进样5次,测得峰面积积分值,计算,得芍药苷的RSD＝1.19%（n＝5）,表明精密度良好。
　　
　　2.6稳定性试验
　　
　　精密吸取同一批号的供试品溶液（批号100318）,按色谱条件分别于制备后0、4、8、12、16、24h进行测定。记录峰面积,计算得芍药苷的RSD＝1.30%（n＝5）,表明芍药苷含量在24h内稳定性好。
　　
　　2.7重复性试验
　　
　　精密称取同一批号（批号100318）的样品5份,按供试品溶液制备方法制备,并按上述色谱条件测定,测得芍药苷平均含量9.73mg/g,RSD＝1.24%（n＝5）。
　　
　　2.8加样回收率试验
　　
　　精密称取已知含量的狼疮灵颗粒0.10g,精密添加一定量的芍药苷对照品,按供试品溶液制备方法制备,并按上述色谱条件测定。结果平均回收率为97.77%,RSD＝0.62%。见表1。
　　
　　2.9样品测定
　　
　　分别精密称取不同批号的狼疮灵颗粒约0.5g,按供试品溶液制备方法制备,按以上色谱条件测试。结果见表2。根据试验结果,考虑到药材的来源,以及制剂生产、储藏等因素,暂拟定每批样品以芍药苷含量为标准,每1g颗粒不得低于9.7mg。
　　
　　表1加样回收率试验结果
　　
　　样品重
　　
　　量（g）样品中含
　　
　　量（mg）加入量
　　
　　（mg）测得量
　　
　　（mg）回收率
　　
　　（%）平均回收
　　
　　率（%）RSD
　　
　　（%）
　　
　　0.10190.9911.0011.96797.43
　　
　　0.10240.9960.9751.95598.35
　　
　　0.10170.9890.9871.94696.9297.770.62
　　
　　0.10150.9870.9901.96198.29
　　
　　0.10230.9950.9841.95897.84
　　
　　表2样品中芍药苷含量测定结果（mg/g）
　　
　　批号芍药苷含量平均含量
　　
　　123
　　
　　1003159.789.719.739.74
　　
　　1003229.749.709.719.72
　　
　　1003299.729.789.789.76
　　
　　3讨论
　　
　　本试验考察了水浴回流提取、超声提取、索氏提取3种方法,结果超声提取法优于回流法和索氏提取法；考察了甲醇、70%乙醇和50%乙醇等3种提取溶媒对芍药苷提取效果的影响,结果甲醇提取效果明显优于70%乙醇和50%乙醇；考察了提取时间对芍药苷提取效果的影响,结果以甲醇为提取溶媒,超声提取20min效果较优。
　　
　　本试验曾采用2005年版《中华人民共和国药典》（一部）赤芍中芍药苷测定所用流动相：甲醇-0.05mol/L磷酸二氢钾溶液（40∶65）,结果主峰分离度不好,存在干扰,经过分析比较,确定了乙腈-0.4%磷酸水溶液（10∶90）为流动相,杂峰集中,可使芍药苷得到较好的分离。
　　
　　本法提取方法简单,分析快速,精密度高,重复性好,阴性无干扰,可较好控制本品的质量。