标题鲜壁虎的高效液相色谱指纹图谱

【摘要】目的建立鲜壁虎的高效液相色谱指纹图谱，探讨不同壁虎间的相似程度。方法采用高效液相色谱法分析鲜壁虎提取液中相关物质的保留时间和吸收强度，对6种壁虎样品共有峰峰面积进行聚类。结果选定的色谱条件给出了较好的保留时间分布和吸收强度，建立起鲜壁虎的HPLC指纹图谱，聚类分析给出了相应结果。结论该HPLC指纹图谱可用于鉴定鲜壁虎，壁虎所含化学成分的多寡等因素与其品种相关。
　　
　　【关键词】鲜无蹼壁虎指纹图谱高效液相色谱法聚类分析
　　
　　壁虎（Gekko）属隶爬行纲有磷目蜥蜴亚目。我国现知有壁虎属动物11种［1］。其性味咸、寒，有小毒，能够祛风、定惊、散结、解毒，治中风瘫痪、历节风痛、风痰惊痫、瘰疬、恶疮、破伤风、痈疮、胃嗝气等症。现代医学认为壁虎对肿瘤、结核等疾病有确切疗效［2～5］。近年来对壁虎抗肿瘤作用的基础研究也有所报道［6，7］。笔者应用“壁虎散”治疗肺癌等肿瘤疗效显著，且副作用很小，是潜在的可开发利用的抗肿瘤中药品种。由于壁虎种类较多，它们体内所含的有效药物成分的种类及含量的多寡均会有所不同。为保证研究中所用壁虎的种属纯正，建立壁虎的高效液相色谱指纹图谱，用于对壁虎的鉴定具有重要的意义。
　　
　　1仪器与材料
　　
　　1.1仪器与试剂黄金系列通用Ⅰ型高效液相色谱仪（126型泵，166型紫外-可见光检测器，GOLD软件；美国BECHMAN公司）；DS-1高速组织捣碎机（上海标本模型厂）。色谱纯乙腈（美国Tedia公司），分析纯95%乙醇。
　　
　　1.2药材实验所用壁虎的物种及来源见表1。壁虎均于9月从产地购买，并经当地药检所鉴定。表16种壁虎的种类及来源（略）
　　
　　2方法和结果
　　
　　2.1色谱条件层析柱：购自大连江申分离科学技术公司（瑞士SpherigelC18填料），4.6mm×250mm，5μm粒度。流动相：A，亚沸水；B，乙腈。梯度洗脱：0～5min，100%A，流速0.7ml/min；5～6min流速由0.7ml/min升至1ml/min；6～16min，0～10%B；16～21min，10～40%B；21～31min，40～60%B；31～46min，60～100%B；46～60min，100%B。进样量10μl；检测波长205nm；室温。
　　
　　2.2供试品的制备购买秋季捕捉的活壁虎，随机选取14～15只（约50g），在容器内放置72h，以消化、排空壁虎体内的食物，蒸馏水清洗晾干后准确称重，置入95％酒精致死，用捣碎机粉碎匀浆（转速：10000/min），50ml95％酒精分两次涮洗捣碎机，合并涮洗液以浸泡匀浆后的壁虎，不时摇动，浸泡24h后抽滤；滤渣用50ml95％酒精再次浸泡提取，抽滤；合并两次的提取液，定容于100ml；置-2℃冰箱内保存；使用时，取一定量的样品液经0.45μm微孔滤膜过滤；当其温度转变为室温后，以10μl进样分析。
　　
　　潍坊干壁虎的处理：将捕捉到的潍坊活壁虎按常规方法制成干品；取15只干壁虎，用100ml95％酒精浸泡1d（软化），用捣碎机粉碎匀浆（转速：10000r·min-1），用原酒精液继续浸泡2d，提取，抽滤；滤液经0.45μm微孔滤膜过滤，以10μl进样分析。
　　
　　2.3方法学考察
　　
　　2.3.1检测波长的确定由于业界对壁虎所含的有效药物成分尚无系统的研究和分析，其有效药物成分组成和结构尚不得而知，为了使壁虎乙醇提取液中所含有的物质能在紫外光检测波长下被最大限度地检出，宜选择短波长进行检测。在选用205，210，215，220nm进行色谱分析后，对比所得色谱图发现：除色谱吸收的强度随波长增大而依次降低外，吸收峰的数量多寡无明显改变，据此而确定205nm为色谱参数，用于色谱检测。
　　
　　2.3.2流动相及柱温的确定实验表明使用空调控制室温，在22～26℃的温度条件下，色谱峰的保留时间没有明显的变化，经5次在该温度范围内的测试，结果显示色谱峰的保留时间、峰高、峰面积数据的RSD均小于1.2%，在室温条件下的测试结果是可靠的。经采用不同的流动相梯度洗脱，方法中所述的梯度是最佳方案，尤其是方法开始的最初5min以0.7ml/min的流速进行洗脱可使保留时间较短（3～8min）的物质得到较好的分离，满足测试的需要。
　　
　　2.3.3稳定性考察取鲜无蹼壁虎的乙醇溶液测试品分别在0，6，12，24，36，48h不同时间进行测试，考察色谱峰保留时间与吸收强度的一致性，如图1中所标示的各指纹峰的保留时间与吸收强度的RSD均小于1.1%。
　　
　　2.3.4仪器精密度实验在空调的设定温度为24℃时，取测试品连续五次进样，图1中各指纹峰的保留时间、峰高及峰面积的RSD均小于0.6%。
　　
　　2.3.5重复性实验取壁虎分4次制作供试品，分别进样。结果显示各指纹峰的保留时间、峰高及峰面积的RSD均小于1.6%。
　　
　　2.4色谱图中选作指纹峰的保留时间区间范围的确定
　　
　　2.4.1壁虎95％酒精提取液的后续处理采用潍坊壁虎作抗肿瘤药用效果研究，匀浆后的壁虎用95％酒精连续浸泡提取5次，抽滤后，合并5次提取的抽滤液，在30℃下减压蒸馏浓缩，除去其中的乙醇，获得带黄色固体沉淀以及脂肪物的水液；添加一倍体积的蒸馏水后，水液经正己烷和二氯甲烷分别各萃取4次，得黄色水溶液。水溶液在30℃下减压蒸馏浓缩，冻干，得棕色浸膏状物。浸膏状物用95％酒精溶解，作硅胶柱层析，得各层析后样品。
　　
　　2.4.2各水溶性样品的抗肿瘤效果用各样品以MTT法对HepG2和CT-26肿瘤细胞作体外抑瘤率实验。其中棕色浸膏状物浓度为5mg/ml时，抑瘤率最高可达37%，硅胶柱层析得到的4#样品，浓度为1mg/ml时，抑瘤率最高可达49%，棕色浸膏状物对小鼠作体内抑瘤实验，通过肿瘤实体称重对比，抑瘤率可达63%。体内、外抑瘤实验均表明壁虎含活性较高的抗肿瘤有效药物成分。
　　
　　2.4.3确定指纹峰的保留时间区间范围通过上述各水溶性样品进行相同色谱条件下的色谱分析，发现各色谱图中的吸收峰的保留时间均在20min以内，考虑到抗肿瘤有效成分是水溶性的（谢爽、王学美的研究也有同样的结论［6，7］），故将保留时间在20min以内作为选取指纹峰的时间界限。
　　
　　2.5聚类分析为进行各种壁虎所含抗肿瘤成分的比较，对各壁虎色谱数据进行了聚类分析。聚类分析使用各壁虎保留时间在20min以内共有的12个吸收峰，以每个壁虎的12个吸收峰的总面积除各吸收峰的峰面积，得到如表2所示的各吸收峰的相对峰面积，以此进行聚类分析。聚类分析使用SPSS统计软件，采用离差平方和法（Ward’smethod）及欧氏距离（Euclideandistance）。表2各壁虎共有吸收峰的相对峰面积（略）
　　
　　2.6结果
　　
　　测试所得各壁虎的HPLC色谱图，其中潍坊壁虎的色谱图如图1所示。
　　
　　实验发现潍坊壁虎干品的色谱图（图2）与鲜品的有很大的差异，故鲜品的指纹图谱不适用于干品。
　　
　　以各鲜壁虎色谱图中保留时间作标记的各吸收峰为指纹峰。取其中吸收强度最大的（保留时间分别为5.234，5.263，5.273，5.246，5.259，5.250）吸收峰为参考峰，确定其它指纹峰的相对保留时间和相对峰高，以归一化法（RAi=Ai/ΣAi）确定各指纹峰的相对峰面积。由色谱中各指纹峰的相对保留时间、相对峰高及相对峰面积（RA），即可构建起样品的HPLC指纹图谱。各鲜壁虎色谱图中吸收峰的保留时间见表3。表3各壁虎HPLC指纹峰的保留时间（略）
　　
　　聚类分析所得的树状关系图见图3。
　　
　　3讨论
　　
　　壁虎和乙醇的选择:为尽可能全面地研究分析壁虎体内所含物质的抗肿瘤活性，需要尽可能多地将壁虎所含物质提取出来。选用乙醇是考虑到乙醇与水的互溶性，选择鲜壁虎是因为鲜壁虎自身含水。在第一遍用乙醇浸泡壁虎匀浆物时，壁虎体内所含的水溶性好的物质可借助于壁虎体液与乙醇的互溶而被提取出来，当抽滤分离后，滤渣中含水甚少，再次用乙醇浸泡滤渣时，可保证其中脂溶性良好的物质也被提取出来。若对壁虎干品进行同样的处理，则干壁虎所含有的水溶性物质就不可能被很好地提取出来。从干、鲜壁虎的色谱图中可以看到，在梯度洗脱的前半段时间，干壁虎的吸收峰数少、吸收强度低，而在后半段时间内，干、鲜壁虎的吸收峰数基本相等，但干壁虎的吸收强度要显著大于鲜壁虎的。
　　
　　关于壁虎的HPLC色谱图：鲜壁虎的乙醇提取液中所含物质种类繁多，在某一特定色谱条件下，不可能使所有的吸收峰都得到良好的分离，尽管在样品洗脱的初始阶段（前20min）吸收峰的分离状况不甚理想，峰的重叠相对较为严重；但色谱数据的稳定性良好，可以满足作为指纹图谱的需要。
　　
　　关于相似度分析：仅从各壁虎在20min以内的吸收峰的保留时间就可发现，在各吸收峰的保留时间序列中，各种壁虎均有峰的缺失。按时间序列，吸收峰的总数有20个，但六种壁虎的共有峰只有12个；因此从图谱的直观上就可以区分出不同的壁虎。为不同壁虎的鉴定提供了依据。
　　
　　聚类分析的结果表明6种壁虎中，G.Sw和G.A最为相似，相似度可达98.61%，当聚为五类时，两者为一类，其他壁虎各自为一类；当聚为四类时，G.Sw和G.A为一类，G.H和G.J为第二类，G.Su和G.T各自为一类；当聚为两类时，G.Sw、G.A、G.T和G.Su为一类，而G.H和G.J为另一类。尽管在目前这12个共有峰尚未归属为某个确定的化合物，但随着研究的深入，各吸收峰的化合物名称及分子结构将一一确定；聚类分析将提供壁虎间相互替代的思路。
　　
　　尚需解决的问题：拟通过后续的进一步分离纯化，以获得抗肿瘤活性成分的纯品及其抗肿瘤效果，并解决指纹图谱中各吸收峰的归属问题。
　　
　　本文所介绍的壁虎HPLC指纹图谱可用于壁虎的鉴定，聚类分析的结果给出了不同壁虎间的相似程度。