标题免疫组化DAB法 显示过氧化物酶

免疫组化DAB法 显示过氧化物酶

〔原理〕 过氧化物酶分解H2O2的过程中，下面反应不直接发生：AH2（供氢体）+H2O2→A（供氢体的氧化物）+2H2O2实验可知，有称为复合物 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、的酶——底物（受氢体）复合体生成，在复合体最后分解为酶和水时，游离的原子氧使供氢体氧化而显色。酶组织化学中所使用的供氢体应是含有色原性基团的发色物质，如奈酚和联苯胺。
免疫组化染色步骤（以ABC法为例）
溶液的配置：
1. 0.1M 2000ml：NaCL 18g, NaH2PO4·2H2O 0.8g, Na2HPO4·12H2O 12g. 共六份
2. 柠檬酸盐缓冲液：
贮存液：0.1M柠檬酸溶液（A）：21.01g 柠檬酸 + 1L 蒸馏水
0.1M柠檬酸三钠溶液（B）：29.41g 柠檬酸三钠 + 1L 蒸馏水
工作液：9ml A液+41ml B液+450ml 蒸馏水→0.01M柠檬酸盐缓冲液
3. 0.03% H2O2-甲醇：30% H2O2 0.4ml + 400ml 纯甲醇→充分混匀
4. 20% 甘油：80ml 纯甘油 + 320ml 蒸馏水
5. 稀释抗体：1︰300 ，1︰400 ，1︰600 （临用前配）
6. 酒精的配置
染色步骤：一步法
1. 载玻片 烤箱中 60℃ 40′。
2. 二甲苯Ⅰ，60℃ 20′（水浴箱中），二甲苯Ⅱ，室温 15′。
3. 脱水，100%→95%→85%→75%酒精，每级均为3′。
4. 蒸馏水冲洗， 5′﹡1
5. 微波炉修复抗原：0.01M 柠檬酸盐缓冲液，99℃ 肺 20′，心肾 12′
6. 3′*3
7. 0.03% H2O2-甲醇，室温20′
8. 冲洗， 3′*3，甩干或纸巾吸去多余液体（勿碰到组织），PAP Pen划境线。
9. block solution 封闭抗原，室温10′。
10. 倾出封闭液，不洗，滴加一抗（60ul），4℃过夜或37℃ 1～2h。
11. 冲洗，3′*3。
12. 除去，滴加A增强剂，室温25′。
13. 冲洗，3′*3。
14. 除去，滴加B剂，室温35′。
15. 冲洗，3′*3。同时配置DAB显色剂。
16. 除去，DAB显色10′（在显微镜下观察染色程度控制染色时间）。蒸馏水冲洗。
17. 复染：苏目素均匀滴加2滴，40′′，蒸馏水冲洗，60℃温水泡半分钟。
18. 脱水：75%酒精→85%→95%→100%（3次），每级3′。
19. 透明：二甲苯Ⅰ3′，二甲苯Ⅱ3′。
18. 封片：中性树脂，加盖玻片（组织部位切勿残留小气泡），60℃ 0.5h烘干。
结果：棕褐色反应产物代表抗原X的定位。
拍照
1. 更换样品时，除了调整焦距和视野外，显微镜上的其他部件都不能动！所有的样品必须一次拍摄完全。特别是在拍摄过程中，不要一会用高倍镜，一会用低倍镜，来回切换物镜。
2. 数码相机必须设置为手动曝光，并且保持每张照片用同样的曝光条件，同样的曝光时间，同样的光圈。特别要注意的是，一定要将数码相机的自动白平衡功能给关掉
3. 免疫组化切片一般染色不太深，因此拍摄出的照片颜色较浅，就让它浅。拍摄出的照片中空白部位应尽可能呈现纯白色。测量其灰度应在250左右。如果呈现淡蓝色，一般是相机自动白平衡在起作用。另外一个因素是显微镜灯光电压不正确。要使灯光本身的色温正确。既不偏黄，也不偏蓝。