标题高效液相色谱法（HPLC）测定饲料中麦角固醇

摘要[目的]建立一种测定饲料中麦角固醇的高效液相色谱法。[方法]首先确定波长,流动相和流速等色谱条件,然后研究KOH浓度、乙醇与KOH溶液比例、皂化温度和时间对麦角固醇得率的影响,确定最佳皂化条件。[结果]高效液相色谱条件为色谱柱HC-C18（4.6mm×150.0mm,5μm）,流动相为纯甲醇,流速1.5ml/min,检测波长281nm,柱温30℃,进样量10μ;l最佳皂化提取条件为KOH质量分数35%,乙醇与KOH溶液加入比例20∶10（V∶V）,皂化温度85℃,皂化时间2h;优化后标准曲线方程为Y=12.541X-7.603,R2=0·99969,线性范围为0.5~50.0mg/m;l添加水平为2.0,4.8和7.5mg/kg时,加标回收率为101%~105%,RSD为1.6%~3.8%（n=5）,最低检测限为0.625mg/kg。[结论]该检测方法快速、灵敏、准确、可靠,适合饲料中麦角固醇的测定。
　　
　　关键词：麦角固醇;高效液相色谱;皂化
　　
　　　
　　麦角固醇的化学名称为24β-13-甲基胆固醇-5,7烯-3β-羟基,又名麦角甾醇[1-3],其结构如图1所示[4]。麦角固醇不溶于水,易溶于甲醇、乙醇、石油醚、庚烷等有机溶剂。麦角固醇对光、热和O2较不稳定,大量地存在于酵母细胞中。此外,麦角固醇在谷物、配合饲料、植物组织、动物器官中都有发现[2]。麦角固醇在紫外线照射下可转化为维生素D2,维生素D2是维生素D的主要成分之一,能够调节Ca、P代谢,维持血钙和血磷水平,用作饲料添加剂能显著增加家禽、鸟类的产蛋率和孵化率[5]。
　　
　　麦角固醇的测定方法主要有紫外分光光度法[6-8]、薄层色谱法（TLC）[9]、液相色谱法（HPLC）[10-15],气相色谱质谱法[16-18]、大气压化学电离与液相色谱质谱联用法（ACPI-MS-MS）[4]等,其中,HPLC法因操作简便,灵敏度高等特点应用较广。目前,很多学者采用HPLC法测定了酵母、菌体中的麦角固醇,但对其他饲料原料涉及较少,且提取及测定条件差异较大。笔者通过研究酵母蛋白粉皂化过程中物料与皂化剂之比、醇碱比、皂化温度以及皂化时间建立测定饲料中麦角固醇的高效液相色谱法,并测定了部分饲料原料中的麦角固醇。该方法的建立,将为饲料原料中麦角固醇的测定提供依据。
　　
　　1材料与方法
　　
　　1.1材料、试剂麦角固醇标准对照品（纯度≥99%）,购自Sigma公司;甲醇（色谱纯）,购自美国Fisher公司;无水乙醇（色谱纯）,KOH（分析纯）,乙醚（分析纯）,购自成都市科龙化工试剂厂;所用水为Millipore仪制得的超纯水。
　　
　　1.2仪器、设备AgilentHP1100高效液相色谱仪配备（VWD紫外检测器）,购自美国安捷伦公司;BeckmanⅡ紫外分光光度计,购自美国Beckman公司;HK6200超声波提取仪,购自上海汉克科学仪器有限公司;HH-S恒温水浴锅,购自江苏国胜试验仪器厂;回流装置（自制）。
　　
　　1.3标准溶液的配制准确称取麦角固醇标准品0.0500g,用无水乙醇定容至100m,l配制成浓度为0.5mg/ml的标准储备液;将标准储备液用无水乙醇梯度稀释,分别配制浓度为250.0、125.0、50.0、5.0、2.5和0.5μg/ml的标准对照品。
　　
　　1.4样品提取精确称取100mg酵母蛋白粉倒入250m的圆底烧瓶中,加入醇碱溶液,在一定温度下（85~90℃）的恒温水浴锅中回流皂化一定时间后,取下圆底烧瓶冷却至室温,加乙醚25ml在超声波振荡器中振荡15min。将皂化液转移到分液漏斗中,静止2h。取上清液于烧杯中,60℃水浴蒸干乙醚,同时充N2防止麦角固醇与空气接触被氧化,蒸干后用无水乙醇定容至50m,l经0.22μm的有机滤膜过滤,上机测定。
　　
　　1.5色谱条件色谱柱:HC-C18柱（4.6mm×150mm,5μm）,柱温:30℃,流动相:纯甲醇,流速:1.5ml/min,检测波长:281nm,进样量10μ,l运行时间:10min。
　　
　　1.6添加回收及精密度试验将麦角固醇标准溶液添加于空白饲料样品中,添加浓度分别为2.0、4.8和7.5mg/kg。添加样品室温静置30min后按照“1.4”的方法提取,测定麦角固醇含量,计算回收率和变异系数,每个添加水平设5个平行。在选定的色谱条件下,5μg/ml的标准品连续测定5次,计算保留时间和峰面积的RSD。
　　
　　2结果与分析
　　
　　2.1色谱条件的选择
　　
　　2.1.1最大吸收波长的确定。对麦角固醇进行最大吸收波长扫描,需要使用适宜浓度的标准品。由图2可知,250.0与500.0μg/ml的麦角固醇标准品浓度高,导致吸收峰与浓度不成相应的比例,因此,笔者采用50.0与125.0μg/ml的麦角固醇标准品进行最大波长扫描,进而确定其最大吸收波长。扫描图中出现了3个吸收峰,其最大吸收波长为281nm,与文献中报道的麦角固醇的最大吸收波长有一定差异[2,4,8,14],但符合麦角固醇最大理论吸收波长的范围280~282nm。因此,采用281nm作为麦角固醇的最大吸收波长。
　　
　　2.1.2流动相的选择。将流动相分别设定为甲醇（97∶3,V∶V）、甲醇/水（85∶15,V∶V）、甲醇（100∶0,V∶V）,其色谱条件如“1.5”,对250.0μg/ml的麦角固醇标准品和饲料样品进行测试,根据标准品和样品的保留时间和信号响应值确定最佳流动相。由表1可知,纯甲醇做为流动相,保留时间最短,且响应信号值提高,分离效果较好。纯甲醇作为流动相,250.0μg/ml的麦角固醇标准品和饲料样品的分离图谱如图3和4所示。因此,选择纯甲醇作为流动相,既能有效分离样品中的麦角固醇,又缩短分析时间,达到快速、高效分离的目的。
　　
　　2.1.3流速选择。将流动相的流速分别设定为1.0、1.5和2·0ml/min,其他色谱条件同“1.5”,对250.0μg/ml的麦角固醇标准品和饲料样品进行测试,根据标准品和样品的保留时间和信号响应值确定最佳流速,结果如表2所示。由表2可知,当流动相流速为1.5ml/min时,标准品及样品的保留时间适中,响应信号值仅略低于1.0ml/min。因此,综合考虑快速分析及分析的灵敏度,流动相流速最终采用1.5ml/min。
　　
　　2.2皂化条件选择
　　
　　2.2.1KOH浓度确定。精确称取酵母蛋白粉100mg,平行5份,放入圆底烧瓶中,分别加入10%、20%、35%、50%和65%的KOH溶液10m,l加入乙醇20m,l皂化时间2h,然后按照“1.4”步骤提取,并按照“1.5”上机条件上机测试,确定最佳的KOH溶液浓度,结果如表3所示。由表3可知,当KOH的浓度升高至35%时,麦角固醇的含量最高,KOH浓度再升高,麦角固醇的浓度开始下降。其原因可能是KOH浓度太高会使麦角固醇与蛋白分子结合,以至于无法从样品中彻底提取麦角固醇,致使麦角固醇含量降低。因此,确定KOH的浓度为35%。
　　
　　2.2.2乙醇与KOH比例的确定。精确称取酵母蛋白粉100mg,平行5份,放入圆底烧瓶中,加入质量分数35%的KOH溶液10m,l分别加入无水乙醇10、20、30、40和50ml于85~90℃皂化,皂化2h,然后按照“1.4”步骤提取,并按照“1.5”上机条件上机测试,最终确定最佳的醇碱比,结果如表4所示。皂化剂碱常用KOH、醇用乙醇或甲醇,但有学者研究表明应用乙醇的效果优于甲醇,因此,试验选择乙醇[19]。由表4可知,随着乙醇加入量的增加,麦角固醇的含量逐渐增高,当乙醇加入量为20ml时达最大,然后趋于平衡,因此,最佳乙醇加入量为20m,l即醇碱比为2∶1。
　　
　　2.2.3皂化时间确定。精确称取酵母蛋白粉100mg,平行5份,放入圆底烧瓶中,加入质量分数35%的KOH溶液10m,l无水乙醇20ml于85~90℃皂化,皂化时间分别设定为1.0、1.5、2.0、3.0和4.0h,然后按照“1.4”步骤提取,并按照“1.5”上机条件上机测试,最终确定最佳的皂化提取时间。由表5可知,随着皂化时间的增加,麦角固醇的含量也逐渐增加,当皂化时间为2h时达最大值,皂化时间再增加,麦角固醇的含量反而减少。原因可能是麦角固醇本身不稳定,皂化时间过长容易导致分解。因此,试验最终确定皂化回流时间为2h。
　　
　　2.2.4皂化温度的确定。精确称取酵母蛋白粉100mg,平行4份,放入圆底烧瓶中,加入质量分数为35%的KOH溶液10m,l无水乙醇20m,l皂化时间2h,皂化温度分别设定为60、70、85和95℃,然后按照“1.4”步骤提取,并按照“1.5”上机条件上机测试,最终确定最佳的皂化提取温度,结果如表6所示。由表6可知,随着皂化温度的提高,麦角固醇的含量逐渐增加,当皂化温度为85℃时,含量达最大。当皂化温度再升高时含量降低,原因可能是皂化温度高导致麦角固醇分解。因此,皂化温度最终确定为85℃,这一结果与其他大多数学者的研究结果一致[19]。
　　
　　2.2.5物料与皂化剂比例的确定。精确称取酵母蛋白粉100mg,平行4份,放入圆底烧瓶中,分别取质量分数35%的KOH溶液5、10、15和20m,l相对应无水乙醇的加入量分别为10、20、30和40m,l于85℃皂化2h,然后按照“1.4”步骤提取,并按照“1.5”上机条件上机测试,确定最佳的固液比。由表7可知,随着皂化剂量的增加,麦角固醇的含量逐渐增加,当KOH与乙醇体积分别为10和20m,l15和30m,l以及20和40ml时,麦角固醇含量趋于平衡。从节约成本角度考虑,皂化剂量最终确定为KOH与乙醇分别为10和20ml。
　　
　　2.3线性关系和检出限在“1.5”色谱条件下进样10μ,l测定0.5、2.5、5.0和50.0μg/ml4个水平的标准工作液,以麦角固醇的浓度（X）为横坐标,峰面积（Y）为纵坐标作图,得回归方程为Y=12.542X-7.603,相关系数R2=0.99969。由图5可知,麦角固醇为0.5~50μg/ml时线性关系良好。根据S/N=3确定该方法的最低检测限为0.625mg/kg。
　　
　　2.4精密度和回收率在选定的色谱条件下进行添加回收试验,3个添加水平分别为2.0、4.8和7.5mg/kg,按照确定的皂化提取条件提取,并按照“1.5”色谱条件上机测定麦角固醇含量,计算回收率,结果见表8。由表8可知,该方法的回收率和标准偏差符合国内外有关标准和法规的要求。在选定的色谱条件下,浓度5μg/ml的标准品连续测定5次,保留时间和峰面积的RSD分别为0.15%和2.99%（n=5）。因此,该方法具有很高的灵敏度与精密度,重复性好,回收率稳定,可以为饲料的麦角固醇定量测定提供参考方法。
　　
　　3·结论
　　
　　试验在确定了检测波长、流动相组成和流速的基础上,对皂化提取麦角固醇时KOH浓度、醇碱比、皂化时间、皂化温度以及物料与皂化剂的比例进行研究,建立了一种饲料中麦角固醇的HPLC检测方法。该方法具有灵敏度高、重复性好、准确度高、简便、快速的特点,适合饲料中麦角固醇的测定。