标题免疫荧光技术（immunofluorescence technique）

免疫荧光技术（immunofluorescence technique）是一种以荧光物作为标记物的免疫分析技术，荧光物质分子在特定条件下吸收激发光的能量后，分子呈激发态而极不稳定，其迅速回到基态时，可以电磁辐射形式释放出所有的光能，发射出波长较照射光长的荧光。用荧光素与已知的抗体（或抗原，较少用）结合，但不影响其免疫活性，然后可将荧光素标记的抗体作为标准试剂，用于检测和鉴定未知的抗原。在荧光显微镜下可以直接观察呈现特异荧光的抗原抗体复合物。

常用的荧光素主要有：

1 ．异硫氰酸荧光素 （FITC） ，最大吸收光谱为 490~495nm ，最大发射光谱为 520~530nm ，呈黄绿色荧光。

2 ．四乙基罗丹明 （RB200） ，最大吸收光谱为 570nm ，最大发射光谱为 595~600nm ，呈明亮橙色荧光。

3 ．四甲基异硫氰酸罗丹明 （TRITC） ，最大吸收光谱为 550nm ，最大发射光谱为 620nm ，呈橙红色荧光。

一、 FITC 标记抗体技术

在碱性条件下， FITC 的异硫氰酸基在水溶液中与免疫球蛋白的自由氨基经碳酰氨化而形成硫碳氨基键，成为标记荧光免疫球蛋白，即荧光抗体。

目前一般实验使用的荧光抗体多为商品化试剂，不需自己合成。

二、荧光抗体染色法

实验原理

荧光抗体染色技术的基本原理是利用抗原抗体特异性结合的特点，用标记有荧光素的荧光抗体检测待检抗原样本，如形成抗原抗体复合物，则其在蓝紫光或紫外光照射下发出荧光，用荧光显微镜进行观察。本实验常用于测定细胞表面抗原和受体，各种病原微生物的快速检查和鉴定，组织内抗原的定性和定位研究以及各种自身抗体的检测等。经典的荧光抗体技术包括直接法、间接法和补体法。

实验材料

1 ．抗原 呼吸道合胞病毒 （RSV） （或待检标本）

2 ．细胞 Hep-2 （或 Hela ）细胞单层

3 ．荧光抗体 1:40 抗 RSA IgG-FITC 标记物； 1:40 抗兔 IgG-FITC 标记物

4 ．中间抗血清 1:200 兔抗 RSV 免疫血清 （Abt）

实验方法

1.制备抗原片

⑴ RSV 感染细胞：用 RSV 感染 Hep-2 或 Hela 细胞单层培养物，在细胞未出现 CPE 前，用胰酶消化使分散，并配制成 4-6 ′ 10 5 个 /ml 的细胞悬液，用吸管将细胞悬液滴加到 10 点镀膜玻片上，每个圆点上约 0.025ml ，再将镀膜玻片放入二氧化碳孵箱， 37 ° C 培养 6~24 小时。培养后的玻片用 pH7.4 的 PBS 漂洗 3 次，干燥后固定。

⑵ 固定：将玻片放入盛有冷丙酮的洗缸中， 4 ° C 固定 20 分钟，漂洗，自然干燥。

⑶ 抗原片的保存：固定好的抗原片最好立即进行荧光抗体染色，若必须保存时，置于低温下密闭保存备用。

2.荧光抗体染色法

⑴ 直接染色法 直接使荧光抗体与玻片上的抗原反应。

① 用吸管滴加 1:40 抗 RSV IgG-FITC 标记物，使其布满整个标本区。将玻片置湿盒中， 37 ° C 孵育 30 分钟。

② 将玻片取出，用自来水冲去多余的标记抗体液后，用 PBS 漂洗 3 次，每次 5 分钟。最后用蒸馏水冲洗 1 次，晾干。

③ 用纯度高的甘油封片，镜检。

⑵ 间接染色法

① 用吸管吸取 1:200 兔抗 RSV 免疫血清，滴于抗原片上，使其布满整个标本区，约 0.025ml 。将玻片置湿盒 37 ° C 孵育 30~40 分钟， PBS 漂洗 3 次，每次 2 分钟。

② 滴加 1:40 抗兔 IgG-FITC 标记物于抗原片上，约 0.025ml 。将玻片置湿盒 37 ° C 孵育 30~40 分钟， PBS 漂洗 3 次，每次 5 分钟。标本不要太干，各染液勿混流。

③ 0.02% 伊文思蓝覆盖 5 分钟，去染液加甘油封片，镜检。

结果判定

荧光显微镜下所观察到的荧光图象主要以两个指标判断结果，一是形态学特征，一是荧光的亮度，必须将两者结合起来综合判断。

特异性荧光呈黄绿色，其强度用“ ++++ ”、“ +++ ”、“ ++ ”、“ + ”、“—”表示。

思考题

1. 何谓免疫标记技术？常用的免疫标记法有那些？

2. 荧光抗体染色的原理是什么？有那些常见方法？

酶联免疫吸附实验（间接法）

酶联免疫吸附实验 （enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA） 是一种用酶标记抗体或抗原，对相应的抗原或抗体进行测定的免疫标记技术。他利用了抗原抗体反应的高度特异性和酶促反应的高度敏感性，可敏感地检测体液中微量的特异性抗原或抗体，具有敏感性高、特异性强、简单、结果便于观察、可用于大规模快速检测等特点。常用方法有直接法、间接法、夹心法和竞争法等。

常用标记酶有：辣根过氧化物酶 （HRP） ，碱性磷酸酶 （AP） ，葡萄糖氧化酶 （GOD） 等。

实验原理

先将用于检测特异性抗体的已知抗原结合到固相载体上，再先后加入待测抗体和酶标二抗进行反应，其间通过洗液的洗涤去除未能固化到固相载体上的成分，这样因为抗原抗体反应的特异性，就保正了只有当检测标本中含可与已知抗原特异性结合的抗体时，标记的酶才能在反应孔中存在而不被洗去，当加入酶的底物后，底物被酶催化产生有色的产物，通过目测或分光光度计检测 OD 值就可测出底物的降解量，从而推知存在于标本中的抗体量。

实验材料

1. 40 孔酶标板

2. 1:300 乙肝表面抗原溶液

3. 1:10 待测血清

4. 健康人血清

5. HBsAg 诊断血清

6. 辣根过氧化物酶标记羊抗人 IgG 抗体（酶标二抗）

7. 抗原稀释液（ pH9.6 碳酸盐缓冲液）

8. 洗涤液（ pH7.4 磷酸盐—吐温缓冲液）

9. 血清稀释液（含 0.1% 牛血清白蛋白的磷酸盐—吐温缓冲液）

10. 底物显色剂（邻苯二胺—— H 2 O 2 溶液）

11. 终止液（ 2M H 2 SO 4 ）

实验方法

1.包被抗原:用抗原稀释液将HBsAg按1:300稀释成工作浓度,加入到40孔酶标板1-9孔,每孔0.1ml。第10孔加稀释液作空白对照。酶标板置湿盒内,4°C孵育过夜。

2 ．洗涤：次日,甩去酶标板中液体,每孔加洗涤液至满,室温放置3分钟后,甩干,再加入洗涤液,重复3遍。目的在于去除未吸附的抗原,最后甩干。

3. 加待测血清：用血清稀释液倍比稀释待测血清，方法如下表：

每管取 0.1ml 分别加入到酶标板相应的 1~7 孔内。第 8 孔加入 0.1ml 健康人血清，作阴性对照。第 9 孔加入 0.1ml HBsAg 诊断血清，作阳性对照。酶标板置湿盒内， 37 ° C 孵育 30 分钟。

4. 洗涤：甩干酶标板中的液体，用洗涤液按照步骤 2 中的方法洗涤 3 遍，最后甩干。

5 ．加酶标二抗：将稀释好的酶标记羊抗人 IgG 抗体按每孔 0.1ml 加入 1~9 孔，第 10 孔仍只加 0.1ml pH7.4 磷酸缓冲液。酶标板置湿盒内， 37 ° C 孵育 30 分钟。

6. 洗涤：同步骤 4 。

7. 加底物显色：将新配制的邻苯二胺—— H 2 O 2 溶液按每孔 0.1ml 加到 1~10 孔中，置湿盒 37 ° C 孵育或室温静置 10~15 分钟。

8. 加终止剂一滴终止显色反应。

结果判定

第 10 孔为空白对照孔，无色，主要用于酶联免疫检测仪的调零。

第 9 孔为阳性对照，显棕黄色。

第 8 孔为阴性对照，无色（有时可因操作不精细或非特异性吸附而呈极浅的黄色）。

实验孔（ 1~7 孔）中结果阳性者，呈棕黄色。随着抗体量的递减，颜色也逐渐变浅。

效价孔的判定，以与阴性对照孔有显著性颜色差异的、血清稀释度最高的实验孔为效价孔，其血清稀释度即为所测抗体的效价。

注意事项：

1. 实验操作中，注意用于不同试剂的吸管、滴管不能混用，以免发生误差而出现假阴性或假阳性结果。

2. 邻苯二胺属有毒化学物质，要避免和皮肤接触。

思考题

1. 酶联免疫吸附实验的基本原理是什么？常用方法有那些？

2. 间接法和直接法相比各有什么优缺点？

放射免疫测定法—— 125 I 标记技术

放射免疫测定 （radioimmunoassay, RIA） 是将同位分析的高灵敏度与抗原抗体反应的特异性相结合，以放射性同位素作为示踪物的标记免疫测定方法。由于此项技术具有灵敏度高（可检测出 ng 至 pg 级的微量物质）、特异性强（可分辨结构类似的抗原）、重复性好、样品及试剂用量少、测定方法易规范化和自动化等优点，因此在医学及其他生物科学研究领域和临床实验诊断中广泛的应用于各种微量蛋白质、激素、小分子药物及肿瘤标志物等的分析与定量测定。

RIA 常用的放射性同位素有 125I、 135I、 3H、14C等，其中以125I最常用。因其具有以下优点 ① 125 I 化学性质活泼，容易标记成功，可以用较简便的方法标记抗原或抗体； ② 125I 衰变过程中不产生b射线，对标记蛋白、多肽等抗原的免疫活性无显著影响； ③ 容易获得高比放性的标记物，测定的灵敏度较高； ④ 释放的g射线可以用晶体闪烁计数仪直接测量，方法简便，易于推广应用； ⑤ 125I的核素丰度、计数率及半衰期（125I60 天,135I 8.1 天）均优与135I 。

标记125I的氯胺T法：（标记甲型肝炎病毒抗体—抗 HAV IgG）

实验原理

氯胺T是氯代酰胺类氧化剂，在水溶液中易分解形成次氯酸，将 125I-氧化成放射性单质碘（125I2），其可取代酉各氨酸残基苯环上的氢原子，或与组氨酸残基的咪唑环共价连接，使蛋白质或多肽发生碘化反应。

实验材料

1. 抗 HAV IgG （约含蛋白 5mg/ml ）

2. Na 125 I （ 比放射性 >20mCi/ml） 1mlCi

3. 0.25M pH7.4 PBS ； 0.05M pH7.4 PBS

4. 氯胺 T 50 m l/100 m l （临用前用 0.25M PBS 配置）

5. 偏重亚硫酸钠 100 m g/100 m l （临用前配置）

6. 1% KI （溶于 0.05M PBS ）

7. Sephadex G25 层析柱（ 1 × 20cm ）：称 10g Sephadex G25 ，用 0.05M pH7.4 PBS 浸泡，漂洗后装柱，然后用溶于同种缓冲液的 1% 牛血清白蛋白（ BSA ） 1ml 上柱封闭，以减少标记蛋白通过时的吸附损耗。

8. 小试管 （用于收集洗脱液的试管应先用 1%BSA 湿润以封闭管壁）

9. 微量进样器

10. 晶体闪烁计数仪

11.15% 三氯醋酸

实验方法

1. 取 1 小试管，加入抗 HAV IgG 2.5 m g ， 0.05M PBS 50 m l ， Na 125 I 800 m Ci （具体体积根据 125 I 衰减表查算）。

2. 再加入氯胺 T 30 m g （快速加入，立即震摇），室温反应 3 分钟。

3. 加入偏重亚硫酸钠 60 m g ，终止反应。

4. 加入 1% KI 200 m l （作为载体，用以稀释放射性碘，减少吸附）。

5. 将上述反应液通过 Sephadex G25 层析柱，待液体进入柱床后，用 0.05M PBS 洗脱，按每管 10 滴 / 分收集，共 45~50 管。

6. 用晶体闪烁计数仪测量各管的放射值，将放射性最强的标记蛋白 3~4 管合并，加 15% 三氯醋酸沉淀蛋白，离心。测定上清和沉淀的 cpm ，求出蛋白沉淀的 cpm 占总 cpm （上清 + 沉淀的 cpm ）的百分率。

7. 计算 125 I 标记蛋白的比放射性：单位重量标记蛋白上的放射性强度称为重量比放射性。计算公式如下：
125 I 蛋白 （ m Ci/mg）= 所用 125 I 总放射性 （ m Ci）× 125 I 标记率 / 所用蛋白总量 （ m g）

注意事项：由于实验中使用了放射性同位素，因此实验过程中所有含 125 I 的液体及试剂均不能随意弃置，需集中处理。另外注意不要让其溅入口、眼。

思考题：

1. 何为放射免疫测定法？其特点是什么？

2. 用 125 I 做为标记物有何优点？

125 I 衰减表