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【摘要】以鲫鱼肌肉为材料，建立了一种简便、准确的反相高效液相色谱法，用于鱼肉中伊维菌素的药物残留检测和药代动力学研究。鲫鱼肌肉中的伊维菌素用乙酸乙酯提取，离心后的上清液于45℃下氮气吹干，残渣用甲醇水（4∶1，V/V）混合液溶解，正己烷去脂，离心后取下清液，进样20μL进行HPLC分析。本方法考察了提取剂、柱温和流动相的影响，确定了以乙酸乙酯为提取剂，柱温25℃和甲醇水（90∶10，V/V）为流动相的优化条件。方法线性范围为0.025～2.50μg/g，相关系数r=0.9997，检出限为11ng/g。批内RSD为1.0%～5.8%，日间RSD为1.0%～7.7%，相对回收率（99.8±4.1）%，绝对回收率为（95.9±3.9）%。本方法具有操作简便，结果准确可靠的特点。
【关键词】伊维菌素，鲫鱼，肌肉组织，残留检测，反相高效液相色谱
1引言
伊维菌素（ivermectin，IVM）为阿维菌素的衍生物，是目前最优秀的广谱抗寄生虫药之一，具有广谱、高效、用量小、安全等优点，对生物体内外寄生虫，特别是线虫和节肢动物均有高效驱杀作用。1981年投入市场后，在临床兽医中得到了广泛应用。而其在水产养殖寄生虫病害防治方面的应用也引起了人们的关注。目前，动物体内伊维菌素残留的检测方法主要有HPLCUV检测法[1]和HPLC荧光检测法[2,3]。但这些方法多为家畜样品的药物残留检测，对鱼体内IVM的测定方法研究甚少。Pantelis等[4]利用酶联免疫吸附测定法（ELISA法）测定了IVM在海鲷内的含量;Zhang等[5]利用液相色谱串联质谱法测定了鳗鱼体内IVM的残留量;赵思俊等[6]采用HPLC法检测动物肌肉中多种药物残留;沈金灿等[7]采用HPLCMS法检测动物肌肉中兽药残留。这些方法各具优缺点，样品前处理过程均较复杂，且耗时。本研究以鲫鱼为实验对象，对肌肉样品的前处理过程进行了优化，采用反相高效液相色谱法分析了鲫鱼肌肉中IVM的残留量。研究结果可为鱼体肌肉组织中IVM的残留检测及药代动力学研究提供参考。
2实验部分
2.1仪器与试剂
SHIMADZU高效液相色谱仪（HPLC），配有SPD20A紫外检测器;SupRa22K冷冻离心机;QGC24T氮气吹干仪;FSH2匀浆机;SK2200L超声波仪;H101漩涡混合器。伊维菌素标准品（Sigma公司）;甲醇（色谱纯，Merck公司）;乙酸乙酯（色谱纯，Urchem公司）;正己烷与无水Na2SO4均为分析纯（国药公司）;水为MilliQ超纯水。
2.2实验方法
2.2.1色谱条件VPODSC18色谱柱（150mm×4.6mm，5μm）。流动相为甲醇水（90∶10，V/V），流速1.0mL/min。柱温为25℃;紫外检测波长为245nm;进样量20μL。
2.2.2标准溶液的配制准确称取50mg伊维菌素标准品于50mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀即得1g/L的标准储备液。精确量取1mL标准储备液于100mL棕色容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，即得10mg/L的标准A溶液。精确量取标准A溶液适量，用甲醇稀释成质量浓度分别为0.025,0.05,0.10,0.25,0.50,1.00和2.50mg/L的系列标准工作液。
2.2.3样品的处理称取鲫鱼肌肉组织（1.0000±0.0010）g于10mL烧杯中，剪碎后加少许无水Na2SO4和3mL乙酸乙酯，以10000r/min匀浆30s，将匀浆液倒入10mL尖底玻璃离心管A中，以3mL乙酸乙酯洗涤刀头和小烧杯，将洗涤液全部倒入A管，超声提取10min，以5000r/min离心8min，将上清液倒入另一支10mL尖底玻璃离心管B中，A管残余物再用5mL乙酸乙酯提取一次，涡旋振荡30s，超声，离心后，合并上清液于B管中，在45℃用氮气将B管提取液吹干后，向B管中加入1mL甲醇水（4∶1，V/V）混合液，超声5min使残渣完全溶解，再加入1mL正己烷，涡旋振荡30s，3000r/min离心3min，取下清液1mL，以0.22μm微孔滤膜过滤，取滤液进行RPHPLC检测。
3结果与讨论
3.1样品处理方法的选择和色谱分析条件的优化
3.1.1提取剂的选择自生物样品中提取IVM的常用提取剂有乙腈、乙酸乙酯和甲醇。通过标准加入实验，测得3种提取剂的平均绝对回收率分别为90.5%,95.9%和83.1%。甲醇提取的回收率最低，且提取物杂质多，对IVM峰的干扰很大。乙酸乙酯和乙腈提取IVM时，基质背景相对干净，IVM峰两边基线平稳，分离效果很好。由于乙酸乙酯提取的回收率最高，且比乙腈更易以氮气吹干，因此选用乙酸乙酯为提取剂。
3.1.2去脂过程的处理本实验用正己烷去脂，但正己烷与甲醇部分互溶，因此，前处理过程中，氮气吹干后的残渣不能直接加甲醇溶解定容。实验发现，甲醇水（4∶1，V/V）混合液能很好地溶解残渣，且与正己烷不互溶。因此，氮气吹干后的残渣用甲醇水（4∶1，V/V）混合液溶解定容。
3.1.3流动相的选择当流动相中甲醇与水的比例分别为100∶0,93∶7,91∶9和90∶10时，IVM的出峰时间分别为3.5,8.1,9.5和13.1min。实验表明，当用甲醇水（90∶10，V/V）为流动相时，IVM与杂质分离良好，基线平稳，左右无干扰峰。提高流动相中甲醇的比例会使IVM出峰时间提前，IVM还未与杂质完全分离就出峰，将导致IVM峰两边的基线不平，因此本实验选用甲醇水（90∶10，V/V）为流动相。
3.1.4柱温的选择比较了20,25和35℃时IVM的色谱图可见，温度越高，IVM的保留时间越短。当用甲醇水（90∶10，V/V）为流动相时，3个温度条件下IVM的保留时间分别为14.7,13.1和10.9min。IVM的峰形变化不大，柱效值分别为3542,3797和4084。高柱温时峰形略尖，但由于保留时间会较短，受样品中背景基质的影响，有时会出现IVM峰两边基线不平的现象。综合考虑保留时间、柱效和分离度，本实验选用柱温为25℃。图1IVM的色谱图
3.2色谱行为
图1为IVM标准工作液、加标肌肉样品及空白肌肉样品的色谱图。由图1可知，在本实验条件下，基线走动平稳，IVM的保留时间约为13min，无干扰峰出现。
3.3标准曲线
取质量浓度分别为0.025，0.05，0.10，0.25，0.50，1.00和2.50mg/L的IVM系列标准溶液20μL，直接进样，进行HPLC分析，每个浓度平行测定2次，在质量浓度为0.025～2.50mg/L的范围内，IVM色谱峰面积与其浓度具良好的线性关系，A1=39683C1-680.34，相关系数r=0.9999。
准确称取空白鲫鱼肌肉样品（1.0000±0.0010）g于10mL烧杯中，剪碎并向小烧杯中分别添加1mL质量浓度为0.025,0.05,0.10,0.25,0.50,1.00和2.50mg/L的系列标准工作液，避光静置1.5h，按2.2.3项方法，每个浓度平行测定2次，在标准加入质量浓度为0.025～2.50μg/g时，肌肉样品中IVM色谱峰面积与其浓度具良好的线性关系，A2=35538C2 274.39，相关系数r=0.9997。
3.4精密度和回收率
分别取含IVM0.125,0.50,2.50μg/g的3种不同质量浓度加标肌肉样品，按2.2.3项方法，每隔一天测1次，共测3次，每个浓度平行测定5次，据此计算批内和日间精密度（RSD），结果见表1。肌肉样品批内RSD为1.0%～5.8%;日间RSD为1.0%～7.7%。肌肉样品的相对回收率为96.9%～101.9%;绝对回收率为91.8%～103.8%。表1鲫鱼肌肉组织中IVM的回收率和精密度
3.5方法检出限
根据美国EPASW846的规定进行方法检出限（methoddetectionlimits，MDL）的研究[8]，测定2组低浓度加标样品（0.05μg/g），每组设7个平行样，进行差异显著性分析，计算标准偏差S。以公式MDL=3.143S求出方法检出限。
取α=0.05，经差异显著性检验可知F=0.64﹤F（0.05）=4.75，两组数据无显著差异。计算可得S=0.003452，MDL=0.011，即本方法的检出限为11ng/g。表2RPHPLC方法检出限的测定结果
IVM在水产养殖中的应用已很广泛，但由于其存在较大的水生态风险，欧洲许多国家并未批准其作为渔药使用，而目前我国尚无这方面的规定。农业部颁布的NY50292001和NY50442001二则无公害食品质量标准规定：猪肉脂肪中IVM的含量不得超过0.02mg/kg，牛肉脂肪中IVM的含量不得超过0.04mg/kg[9，10]。尽管IVM在鱼肉中的最高残留量尚无规定，鉴于目前IVM在水产养殖中的广泛应用及食品安全的重要性，研究出一种适合检测鱼肉内IVM含量的方法已十分必需。本实验以鲫鱼为实验对象，对肌肉样品的前处理过程进行了优化，省去SPE柱净化环节，然后采用RPHPLC紫外检测法对其进行检测。实验方法简便，回收率高，且获得了良好的IVM色谱图。本方法的检出限为11ng/g，低于商检行业标准的方法检出限（0.015mg/kg）[11]。本方法操作简便、快速、准确，适用于IVM在鱼体内的药代动力学研究及鱼体内IVM的残留检测分析。
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