标题高效液相色谱法测定山楂果实中槲皮素的含量

【摘要】目的建立高效液相法测定山楂中槲皮素含量的方法。方法色谱条件：Shim-PackVP-ODSC18柱，流动相为甲醇-0.4%磷酸溶液（52∶48,V/V），检测波长为373nm。结果槲皮素的回归方程为Y=2855.4X-10974（r=0.9999，n=5），线性范围为0.0189～0.0566μg；平均回收率为96.44%，RSD为1.51%。结论此法简便、结果可靠，为山楂药材的质量控制提供快速准确的测定方法。
　　
　　【关键词】山楂槲皮素 高效液相色谱法 含量测定
　　
　　山楂为常用中药,具有消食健胃和行气散淤的功效,其主要成分为黄酮类和有机酸类化合物［1］。山楂可降压、降血脂、增加冠脉流量、强心和抗心律不齐，有效成分为黄酮类化合物［2］，其果实主要成分为槲皮素和金丝桃苷［3］。目前,《中国药典》仅测定了其有机酸（以枸橼酸计）的含量，并未对黄酮类成分槲皮素的含量测定法进行规定。本文参阅文献［4~6］用反相高效液相法对山楂果实提取物中的槲皮素进行了含量测定方法学的研究。结果表明,该测定方法准确、灵敏、重现性好,获得了满意的结果。为建立山楂果实中槲皮素的含量测定方法,制定山楂中槲皮素的含量限度,进一步完善山楂的质量标准提供参考。
　　
　　1仪器与试药
　　
　　电子分析天平（AUW220D,SHIMADZU）；CQ2500型超声波清洗器（上海必能信超声有限公司）；恒温水浴锅（常州国华电器有限公司）；UV-2450型紫外可见分光光度计（SHIMADZU）；高效液相色谱仪（日本岛津公司）：LC-10ATvp泵，SPD-10Avp紫外检测器，CTO-10ASvp柱温箱，HW色谱工作站。药材山楂（市售，经南京医科大学药学院天然药物化学与生药学教研室陈立娜博士鉴定）；槲皮素对照品（中国药品生物制品检定所，含量测定用，批号10081-9905）；甲醇（色谱级），去离子水（南京医科大学分析测试中心提供），磷酸（分析级）。
　　
　　2方法与结果
　　
　　2.1色谱条件色谱柱为Shim-packVP-ODSC18柱（150mm×4.6mm,5μm）；流动相：甲醇-0.4%磷酸溶液（52∶48）；流速0.8ml/min；检测波长373nm；柱温30℃；进样量10μl。
　　
　　2.2对照品溶液的制备精密称取在105℃干燥至恒重的槲皮素对照品适量，加甲醇制成每毫升含槲皮素4μg的溶液，作为对照品溶液。
　　
　　2.3供试品溶液的制备取药材粉末约1.1g,精密称定，置锥形瓶中,加入甲醇40ml,25%盐酸溶液5ml摇匀,超声处理20min,移置水浴中加热回流2h，迅速冷却至室温,甲醇定容至50ml量瓶中,摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。取对照品溶液、供试品溶液于上述色谱条件下进样，得HPLC图谱（见图1），分析得系统适用性实验结果。见表1。
　　
　　图1HPLC图（略）
　　
　　表1系统适用性实验结果（略）
　　
　　2.4线性范围的考察分别精密吸取槲皮素对照品溶液（3.8μg/ml）5.0，7.5，10.0，12.5，15.0μl，依次注入液相色谱仪，按上述色谱条件，分别进行分析，测定其峰面积值，并以对照品量（X）为横坐标，峰面积值（Y）为纵坐标，得槲皮素回归方程：Y=2855.4X－10974（r=0.9999，n=5）。结果表明：槲皮素对照品在0.0189～0.0566μg范围呈成良好的线性关系。
　　
　　2.5进样精密度实验精密吸取槲皮素对照品溶液10μl，连续进样6次，测定峰面积值，计算RSD=0.35%。
　　
　　2.6溶液稳定性实验取供试品溶液，每隔1h时进样、测定一次，结果表明：供试品溶液在所测的4h内测得的结果基本一致，槲皮素的RSD=1.27%。
　　
　　2.7重复性实验取同一批号样品6份，按供试品溶液制备项下方法制备并测定，结果槲皮素含量为山楂果实生药量的0.0132%。
　　
　　2.8回收率实验取已知槲皮素含量（0.0132%）的样品6份，每份约0.65g，分别精密加入槲皮素对照品溶液（0.0850mg/ml）1ml，按供试品溶液制备项下方法制备并测定，结果平均回收率为96.44%，RSD为1.51%。
　　
　　2.9样品含量测定按“2.3”项下方法制备3批市售山楂药材供试品溶液，分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液，按上述色谱条件测定，以外标法计算含量。结果见表2。
　　
　　表2样品中槲皮素含量测定结果（略）
　　
　　3讨论
　　
　　实验中分别采用了甲醇-0.4%磷酸溶液，甲醇-0.2%磷酸溶液两个不同的流动相系统进行实验，当将甲醇-0.4%磷酸溶液系统调整为（52∶48）时，不仅分离效果好，灵敏度较高，且大大缩短了待测组分的保留时间（与文献［4,5］相比）。故最后选择甲醇-0.4%磷酸溶液（52∶48）为本实验的流动相系统。
　　
　　另外，本实验供试品溶液的制备方法与文献［4］的方法相比较简单，所提得待测组分的含量是文献［4］报道的2.3倍。
　　
　　本文考察了3批不同批次山楂药材中槲皮素的含量。建立了一种更准确、简单、快速的HPLC测定方法，对于评价山楂药材及其制剂的质量提供了更为有效的方法。