标题液相色谱技术及液质联用技术在食品及农产品残留检测中的应用

作者:安蓉摘要：讨论液相色谱相关技术及其在残留分析中的应用。先容了用于样品前处理的固相提取技术（SPE）、液相色谱技术（HPLC）、液质联用技术（LC／MS）的特点，及其在食品及农产品中兽药、农药及毒素类有毒有害物质残留分析中的应用。
　　
　　1前言
　　
　　残留监测作为食品安全的重要课题，需要使用多种样品前处理手段与分析检测手段。高效液相色谱和液质联用技术的不断发展，使之越来越广泛地应用于不同类型兽药、农药及毒素类有毒有害物质的检测分析之中。与其他液相色谱应用不同的是：食品及农产品之残留分析对灵敏度、重现性与选择性的要求非常高，经常需要在复杂的基质中检测ppb级甚至更低浓度水平的痕量残留物质。若想达到上述目标，不仅可能需要良好的样品前处理手段来净化复杂的食品及农产品本底，浓缩目标组分，而且需要选择高性能、高灵敏度的HPLC或LC／MS系统进行检测分析。
　　
　　本文将从样品前处理的固相提取技术、HPLC及LC／MS技术角度讨论在食品、饲料及农产品中农药、兽药残留、生物毒素及其他有毒有害残留物质的分析。
　　
　　2用于样品前处理的固相提取技术
　　
　　高效提取与净化食品及农产品样品，改善检测选择性与灵敏度无论使用LC，GC，LC／MS及从等仪器方法，皆须对样品进行前处理。在众多方法中，固相提取技术是近年来发展最快，应用范围越来越广泛的技术之一。固相提取技术（SPE）是基于液相色谱技术原理、采用固体色谱填料净化样品本底或提取溶液中目标组分的样品前处理技术。与液液萃取技术相比，SPE技术操纵简便、提取效率高、溶剂消耗低、轻易自动化，更轻易获得高回收率的结果。
　　
　　1978年，Waters首次将SPE技术推向商品化。并注册了名为sep-Pak的固相提取产品商标，此后，Sep-Pak固相提取技术得到了非常广泛的应用。
　　
　　SPE技术固相提取填料有反相、正相、离子交换等多种类型，有Cl8，C8，C2，-NH2，-Diol，-CN，Silica，Flofisil，氧化铝，聚合物基质，阴／阳离子交换及DNPH等多种吸附剂。1996年，又推出新型通用性填料OasisHLB和具有高选择性的双重机理填料（如OasisMCX／MAX-同时具有离子交换和反相双重机理），可用于酸性、碱性和中性有机化合物的同时提取，以及酸性或碱性化合物的高选择性分别提取。新型Oasis填料的推出，又进一步拓展了SPE技术的应用领域，建立了SPE技术回收率、重现性及通用性等性能的新标准。
　　
　　在食品和农产品及饲料残留检测中，多次采用SPE实现样品净化及目标组分富集的目的。肉中抗生素类药物（如四环素类、氯霉素等）、磺胺药物、喹诺酮类药物、激素类（如己烯雌酚）、克伦特罗、呋喃唑酮、呋喃西林等兽药；氨基甲酸酯、有机磷等农药；黄曲霉素、棒曲霉素等毒素均可采用SPE手段进行提取多残留分析亦有使用基质固相分散提取（MatrkSolidPhaseDispersionExtraction）技术与凝胶渗透色谱方法（GPc）进行样品前处理。
　　
　　3液相色谱技术：残留检测的重要工具HPLC可用于难挥发、极性较强物质的分析。据估计，GC方法仅能解决20％左右有机物分析，而80％左右的有机物可用HPLC方法进行分析。兽药的特点使之通常比较适合HPLC分析；农药残留分析中亦有不少采用了HPLC方法。与其它常规HPLC应用不同的是：残留分析需要高灵敏度与重现性。高灵敏度方可达到对复杂基质中痕量目标组分的良好检测结果；而高重现性是获得高置信水平判定的基本保证。为达到上述目的，需要对HPLC系统进行优化。
　　
　　3．1商灵敏度：残留分析的必要条件色谱结果的灵敏度通常靠信号与噪音的比值（即信噪比）来衡量。因此，无论进步检测信号的响应值，或降低噪音皆可达到进步灵敏度的目的。对于HPLC系统而言，信号强度的进步主要得益于检测器的性能。
　　
　　大多数物质的紫外吸收特性使紫外检测器成为多残留分析最常用的通用型HPLC检测器，多用于快速筛选多种兽药或农药残留的检测手段。如磺胺药物残留、四环素残留、呋喃唑酮、氯霉素、四环素等。具有专利梯形狭缝池设计的双通道紫外检测器充分吸收氘灯的能量，可获得高灵敏度的检测结果。
　　
　　具有高灵敏度与选择性的荧光检测器可作为残留分析的有效工具。第一个用于多残留分析的氨基甲酸酯AOAC方法即使用了柱后衍生定光检测的分析方法。最新研制多波长荧光检测器，独特的轴向照明活动池设计，最大程度地降低了光散射，有效加长了池长；检测器所采用的新型氤灯亦可发射出更高的光能，上述优化设计可为低浓度样品提供无可相比的高灵敏度荧光检测。
　　
　　由于多数化合物无自然荧光响应，很多使用荧光检测器的方法需要采用柱后衍生方法使目标组分产生或进步荧光响应特性，达到高灵敏度检测之目的。采用一种为氨基甲酸酯分析特别优化的HPLC系统，可以同时分析11种氨基甲酸酯及其代谢产物。该系统不仅可以用于高灵敏度检测氨基甲酸酯残农药残留，而且可以用于多种需要柱后衍生-荧光检测或无须衍生自然荧光物质的残留分析中。Woell等人用此系统之柱后衍生．荧光检测方法成功地分析了一些蔬菜、水果、谷物及水中草甘膦及其代谢产物残留。
　　
　　谷物、花生及其他基质中黄曲霉素的痕量分析亦可采用上述系统进行分析。检测器优化的系统可以轻松达到ppt级的检测水平。
　　
　　3．2多残留分析与化合物确认：充分发挥光电二极管矩阵检测器的光谱功能光电二极管矩阵检测器（PDA）作为紫外检测器之一，不仅可以得到色谱信息，而且可以得到化合物的实时光谱信息。PDA检测器的光谱功能，使之非常适合于多残留分析与化合物确认。新型PDA检测器可以在1．2nm高分辨率下获得高灵敏度检测，获得高质量的光谱信息。上述特点不仅使之可用于高灵敏度检测，而且可以用于化合物的光谱确认。此外，亦可收集多通道2D色谱图，对于优化多种不同残留物质检测波长提供了极大的方便。
　　
　　日本、台湾及美国均有研究职员使用PDA检测器进行多残留分析或化合物确认。利用PDA检测器不仅获得了各个被测物质的紫外光谱，可用此光谱进行光谱比较以确认目标组分，排除假阳性结果，而且优化了不同残留物质的紫外检测波长。所检测的残留物质包括在动物组织、肉、水产品、蛋等食品或农产品基质中磺胺药物、喹诺酮类、硝基呋喃类、尼卡巴嗪、氯羟吡啶（clopido1）、喹乙醇等。
　　
　　3．3HPLC重现性：残留分析的可靠保证残留分析的重现性要求I-IPLC系统具有长期稳定的性能。创新设计的HPLC系统具有最高流速精度，可获得最佳的保存时间与峰面积结果重现性。精确与正确的溶剂混合与整体优化，最大程度地降低了HPLC过程的可变性，能够区分样品之间的细微差别。
　　
　　3．4HPLC在残留检测中的应用
　　
　　●兽药残留
　　
　　动物源食品中硝基呋喃类残留（呋喃唑酮、呋喃西林、呋喃妥因、呋马唑酮）、磺胺类药物残留（磺胺对甲氧嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺喹嚼啉）、喹诺酮类（嚼喹酸、萘啶酸）氯羟吡啶、莫能菌素和盐霉素、乙氧酰胺苯甲酯、氯霉素、伊维菌素、克伦特罗、尼卡巴嗪、土霉素、四环素、金霉素（国标GB／T14931．1）、阿莫西林、盘尼西林及喹乙醇等。
　　
　　●农药残留
　　
　　氨基甲酸酯农药、有机磷农药、百草枯、杀草快、草甘膦及氨基膦酸、苯并眯唑类杀菌剂、利谷隆（1inuron）、灭草隆mosuron）及敌草隆（diuron）、三嗪类农药；快速筛选110种农药.
　　
　　苯并眯唑类杀菌剂残留的多残留分析亦可采用HPLC方法。有人用UV及荧光检测方法分析了葡萄、豆类、莴苣、草莓和西红柿中的杀菌剂，包括thiabendazole（噻苯达唑），carbenclm~im，benomyl（苯菌灵，），thiophanate-methyl。这些化合物Uv最大吸收在250～305rim，其中thiabendazole（噻苯达唑），carbendaz．im，benomyl（苯菌灵，）具有自然荧光，可用荧光检测来分析。
　　
　　多数有机磷多残留分析方法可采用Gc为分析手段，但Bmyan等人使用Uv检测技术分析了稻米中的多种农药残留：包括carbaryl（西维因），fenitrothion。pirimiphos-methyl，chlorphfifos-methly，methacrifosetrimfos这些有机磷农药可以使用Sep-PakFlorisil小柱来提取净化。快速筛选农药残留的方法亦采用HPLC方法检测。
　　
　　饲料中农药分析亦可采用HPLC法。Alan和Bushway使用Waters仪器开发了饵料中快速分析多种农药（rotenone鱼藤酮，warfarin杀鼠灵，carbaryl西维因，strychnine士的宁或番木鳖碱）的方法。饲料中的其他农药亦可采用HPLC方法，如Thiamphenicol甲砜霉素，四环素等。尽管此项应用不在残留分析之列，但相应方法思路可供鉴戒。
　　
　　HPLC色谱亦适合于以下类型样品的残留分析，如：
　　
　　●生物毒素及其他有毒有害残存物质——毒素：黄曲霉素、棒曲霉素；
　　
　　●外因性内分泌干扰物质——激素类（己烯雌酚）、多环芳烃、五氯酚；
　　
　　●过渡金属（牛奶中）及碱土金属分析。
　　
　　4液相色谱与质谱联用技术：多残留分析与快速筛选方法的首选工具质谱检测器可以检测多种样品，且具有高灵敏度，可以获得不同与常规HPLC检测器的大量而丰富的结构信息。然而，尽管质谱经常可以得到化合物分子离子及碎片的信息，但混合物的质谱解析往往难以实现。液相色谱与质谱联用，可以首先将混合物分离为单一组分，之后再用质谱检测器进行检测。如此过程不仅可以得到更有意义的质谱数据，而且可以在一定程度上排除基质干扰，克服离子抑制现象，优化质谱检测信号。HPLC的分离能力与质谱检测器的丰富信息与高灵敏度，使采用质谱检测器作为HPLC检测手段的液质联用技术成为目前发展最迅速的分析手段之一。
　　
　　液质联用系统是残留分析理想的检测手段。对于需要高灵敏度、宽适用范围、复杂基质的多残留快速筛选工作而言，液质联用无疑是首选的最佳检测手段。分析现代液质联用技术的发展，尤其是常规台式液质联用系统的发展，使质谱检测器作为HPLC高灵敏度的通用型检测器在常规分析中发挥越来越大的作用。
　　
　　ZQLC／MS系统是大气压电离源（API）的液质联用系统。该系统配有专利的Zspmy接121，具有极强的抗污染能力和高灵敏度（1．0Pg利血平信噪比70：1），质量范围可达40（}0tm‘lu。简单易用的系统和友好的操纵界面，使系统非常适合于残留物质的快速筛选、确认与定量分析。zQ液质联用技术不仅可以获得极高的灵敏度独特的选择性，而且适合多种不同来源、不同类型样品的分析。新型ESCi源的设计，将电喷雾（EsI）与大气压化学（APcI）源的特点合为一体，一次进样可同时得到ESI ，ESI-，APcI ，及APCI-的质谱信息，为多种残留物质的快速筛选提供了极大的方便。
　　
　　日本Waters液质联用实验室研究了动物组织中多种合成抗菌剂的快速筛选与确认分析、水稻与西柚中多种农药分析、氨基甲酸酯农药及雌激素的痕量分析等；Waters北京实验室研究了四环素类、氨苄西林、磺胺等22种兽药等；美国液质联用实验室亦研究了盐酸克伦特罗等兽药残留的分析，还与美国国家环保局（EPA）合作开发氨基甲酸酯农药及其代谢产物的LC／MS快速筛选分析方法。