标题人肿瘤排斥性抗原gp96酶联免疫分析ELISA试剂盒使用说明书

预期应用
ELISA法定量测定人血清、血浆、细胞培养物上清或其它相关液体中gp96含量。
实验原理
糖蛋白96（glycoprotein96, gp96）是热应激蛋白家族的一个成员，存在于内质网内膜上。近年研究发现，gp96作为分子伴侣可结合细胞中的肽库。当病毒感染或肿瘤发生时，gp96可与抗原肽结合。随后gp96-抗原肽复合物在一个受体介导的作用下将抗原肽传递给巨噬细胞或其它抗原递呈细胞，经抗原递呈途径，抗原肽被递呈给MHCⅠ类分子，进而激活特异性CTL和记忆性T细胞，引起机体的细胞免疫反应。通常认为，在这个过程中gp96只起抗原传递载体的作用，本身没有发生变化。
本试剂盒应用双抗体夹心酶标免疫分析法测定标本gp96水平。用纯化的抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入gp96抗原、生物素化的抗人gp96抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的gp96呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。
试剂盒组成
酶联板：一块（96孔）
标准品（冻干品）：2瓶，每瓶临用前以样品稀释液稀释至1ml，其浓度为10 ng/mL，做系列倍比稀释后，分别稀释成10ng/ml，5 ng/mL，2.5 ng/mL ，1.25 ng/mL，0.62 ng/mL，0.31 ng/mL，0.15 ng/mL，其原液直接作为最高标准浓度，样品稀释液直接作为标准浓度0 ng/mL，临用前15分钟内配制。
样品稀释液：1×20ml/瓶。
检测稀释液A：1×10ml/瓶。
检测稀释液B：1×10ml/瓶。
检测溶液A：1×120ul/瓶（1：100）临用前以检测稀释液A1：100稀释。
检测溶液B：1×120ul/瓶（1：100）临用前以检测稀释液B1：100稀释。
底物溶液：1×10ml/瓶。
浓洗涤液：1×30ml/瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍。
终止液：1×10ml/瓶（2N H2SO4）。

标本的采集及保存
1．细胞培养物上清：请离心后收集上清，并将标本保存于-20℃，且应避免反复冻融。
2．血清：标本请于室温放置2小时或4℃过夜后于1000 x g离心20分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融。
3．血浆：可用EDTA或肝素作为抗凝剂，标本采集后30分钟内于2 - 8° C 1000 x g离心15分钟，或将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融。
注：标本溶血会影响最后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。

操作步骤
各试剂在使用前平衡至室温。
加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。除空白孔外，余孔分别加标准溶液或待测样品100ul，轻轻混匀，37℃，120分钟。
弃去液体，甩干，不用洗涤。
每孔加检测溶液A工作液 100ul，37℃,60分钟。洗板3次，350ul/每孔，甩干。
每孔加检测溶液B工作液 100ul，37℃，60分钟，洗板5次，甩干。
依序每孔加底物溶液90ul，37℃避光显色30分钟。
依序每孔加终止溶液50ul，终止反应。用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度（OD值）。
注：
1． 每次实验留一孔作为空白调零孔，该孔不加任何试剂，只是最后加底物溶液及2NH2SO4。测量时先用此孔调OD值至零。
2．为防止样品蒸发，试验时将反应板放于铺有湿布的密闭盒内。
洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可触及板壁）或甩掉酶标板内的液体；在实验台上铺垫几层
吸水纸，酶标板朝下用力拍几次；将推荐的洗涤缓冲液至少0.4ml注入孔内，浸泡1-2分钟，根据需要，重复此过程数次。
    自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。
特异性
    本试剂盒可同时检测重组或天然的人gp96，且与其它相关蛋白无交叉反应。
计算
  以标准物的浓度为横坐标（对数坐标），OD值为纵坐标（普通坐标），在半对数坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。
注意事项
洗涤过程非常重要，不充分的洗涤易造成假阳性。
一次加样时间最好控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。
请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。
如标本中待测物质含量过高，请先稀释后再测定，计算时请最后乘以稀释倍数。
5．在配制标准品、检测溶液工作液时，请以相应的稀释液配制，不能混淆。
6．底物请避光保存。
检测范围：
0.05 ng/mL -20 ng/mL
说明
1．试剂盒保存：-20℃（较长时间不用时）；2-8℃（频繁使用时）。
2．有效期：6个月
3．浓洗涤液会有盐析出，稀释时可在水浴中加温助溶。
4．中、英文说明书可能会有不一致之处，请以英文说明书为准。