标题叶酸的测定方法

微生物法
1.原理
叶酸是酪乳酸杆菌（Lactobacillus casei, L. C, ATCC 7469）生长所必需的营养素。在一定条件下，L.C的生长繁殖与培养基中叶酸含量呈正比关系，细菌增殖的量以光密度值计，通过与标准曲线相比较，计算出样品中叶酸的含量。
2.适用范围
参考《Methods of Vitamin Assay》，第4版。本方法适用于各类食物中叶酸的测定。检测限为0.1ng。
3.仪器与设备
（1） 恒温培养箱
（2） 离心机
（3） 高压消毒锅
（4） 震荡器
（5） 接种针和接种环
（6） 分光光度计
4.试剂
除特殊说明外，本实验中所有试剂均为分析纯，水为蒸馏水。
（1） 菌种：酪乳酸杆菌（Lactobacillus casei, L.C, ATCC 7469）
（2） 磷酸缓冲液（0.05mol/L, pH6.8）:称取4.35g Na3PO4·12H2O,10.39g Na2HPO4·7H2O溶解于800ml水中。临用前用约5g抗坏血酸调节pH至6.8。（注：叶酸对光、热敏感，易被氧化破坏，抗坏血酸有助于保护叶酸被氧化。）
（3） 鸡胰酶溶液： 称取100mg干燥的鸡胰酶（Difco公司）（注：含有叶酸轭合酶，用于水解叶酸多谷氨酸盐）， 加入20ml磷酸缓冲液制成匀浆，3000rpm离心10min,取上清液备用。临用前现配。
（4） 蛋白酶-淀粉酶溶液：分别称取200mg蛋白酶（Sigma公司）和淀粉酶（Sigma公司），加入20ml磷酸缓冲液制成匀浆，离心3000rpm 10min,取上清液备用。临用前配制。
（5） 2+8乙醇溶液：量取20ml无水乙醇溶液，加入80ml水混匀。
（6） 01mol/L NaOH: 称取0.4g氢氧化钠，加2+8乙醇溶液溶解并稀释至1L。
（7） 10mol/L NaOH。称取400g氢氧化钠，加水溶解并稀释至1L。
（8） 叶酸标准储备液（200mg/ml）：准确称取200mg叶酸标准品（Sigma公司，纯度大于98%），用0.01mol/L NaOH溶解并定容至1L。储存于棕色瓶中。
（9） 叶酸标准中间液（200ng/ml）：准确吸取1.0ml叶酸标准储备液，用0.01mol/L NaOH 溶解并定容至1L。储存于棕色瓶中。待标定。
标定：准确吸取1ml叶酸标准中间液，用0.1mol/L NaOH定容至10ml。以0.1mol/L NaOH调零点，比色杯厚度1cm，波长256nm，测定3次紫外吸光度值，取平均值，按下式计算标准中间液浓度。

式中：
X1 －－ 叶酸标准中间液浓度，ng/ml；
A －－ 标准中间液平均紫外吸光度值；
E －－ 摩尔消光系数24,500；
M －－ 叶酸分子量441.42；
10－－ 测定紫外吸光度值时的稀释倍数；
106 －－ 由g/L换算成ng/ml的换算系数。
（10） 叶酸标准工作液（0.2ng/ml）:准确吸取1.0ml叶酸标准中间液，用磷酸缓冲液稀释定容至1L。
（11） 2.4mol/L HCl：量取20ml浓盐酸，加水稀释至100ml。
（12） 酶解酪蛋白溶液：将8g碳酸氢钠溶解于1L水中，加入60g去维生素酪蛋白（Sigma 公司），用10mol/L NaOH调节pH至 8.0（调pH时应小心，不要过碱后再加酸反复调节，避免酪蛋白结块）。加入300mg胰酶，搅拌20min，使胰酶混匀充分。再加入2.5ml甲苯，置37℃恒温箱酶解48～72h（此步骤是将酪蛋白酶解为L.C可以利用的小分子肽。酶解时间不易超过72h，如时间过长，配成的培养基不利于细菌生长）。将酪蛋白液从恒温箱中取出，121℃高压30min以终止反应并去除甲苯。冷却，加10g硅藻土搅拌，用垫有滤纸的布氏漏斗过滤。向滤液中加入约60ml冰乙酸调节pH至3.7。称取活性炭12g，加入滤液中搅拌10min，用布氏漏斗过滤，重复三次。每次过滤时，布氏漏斗内加有10g硅藻土协助过滤。最后滤液用水稀释至1200ml，4℃冰箱保存1年（活性碳可吸附酪蛋白中的叶酸以减少试剂空白，同时也可吸附肽及氨基酸，应注意控制搅拌时间）。取10ml酶解后的酪蛋白溶液加入已称重的蒸发皿中，沸水浴蒸发至干。将蒸发皿置于100℃恒温烤箱内干燥至恒重，在干燥器中冷却至室温。称量蒸发皿的重量，蒸发皿内固体重量，如固体重量小于400mg，即每毫升酪蛋白溶液中固体含量<40mg，则弃除酪蛋白液，重新制备。
（13） 黄嘌呤溶液：取0.4g黄嘌呤，加入10ml氨水，加热溶解，用水稀释至100ml。冰箱保存。
（14） 腺嘌呤-鸟嘌呤-尿嘧啶：分别称取刘酸腺嘌呤，盐酸鸟嘌呤和尿嘧啶各0.2g，加入2.4 mol/L HCl溶液10 ml，加热溶解，用水稀释至100ml，室温贮存。
（15） 乙酸缓冲液（1.7mol/L,pH4.5）：38.65g无水乙酸钠，19.8ml冰乙酸，加水稀释至500ml。
（16） 维生素溶液：取10mg核黄素溶解于40 ml乙酸缓冲液中。取0.2mg生物素，2.5mg NaHCO3，20mg对氨基苯甲酸，40mg盐酸吡多醇，4mg盐酸硫胺素，8mg泛酸钙，8mg尼克酸溶解于50ml水中。将上述两种溶液混合，加水至100ml。
（17） 吐温-80溶液：将2g吐温-80加入100ml 45℃水中，混匀。
（18） 还原型谷胱甘肽溶液：取0.1g还原型谷胱甘肽，加水至100ml.
（19） 甲盐溶液：称取5g磷酸氢二钾和2g磷酸二氢钾，加水溶解至100ml，液面上加入少许甲苯保存。
（20） 乙盐溶液：称取2 g刘酸镁，0.5 g刘酸亚铁和0.5 g刘酸锰，加水至100 ml，液面上加少许甲苯保存。
（21） 基础培养基：按下表配制，最终定容至500ml。

加水至250 ml，搅拌，用10mol/LnaOH溶液调节pH 6.8±0.1，然后加入乙盐溶液2.5 ml，磷酸缓冲液200 ml,用水补至500 ml。4℃冰箱内可保存一周 。
（甲、乙盐混合后易产生沉淀，所以配培养基时不可同时加入，加入甲盐后先调节pH再加入乙盐。基础培养基也可直接选购DIFCO公司生产的叶酸测定用培养基）
（22） 琼脂培养基：

加水至100 ml，置水浴煮至琼脂完全熔化，调节pH 6.8±0.1。尽快倒入试管中，每管3～5 ml，塞上棉塞，121℃高压灭菌15 min,取出后直立试管，冷却至室温.于冰箱内保存。
5.菌种制备与保存
（1） 储备菌种的制备：将L.C纯菌种转接至2个或多个琼脂培养基管中。37 ℃±0.5 ℃恒温培养箱中培养16～24 h。贮于冰箱内，每周转种一次留作储备菌种。
（2） 种子培养液的制备：取2 ml叶酸标准使用液和10 ml基础培养基，混匀，分装至4支5 ml离心管中，塞上棉塞，121℃高压灭菌15 min，实验时现制。