标题高效液相色谱法同时测定血清中头孢哌酮和舒巴坦的含量

摘要报告了用高效液相色谱法同时测定血清中头孢哌酮和舒巴坦的含量。本法以外标法为基础，0.5mL血清标本经甲醇沉淀蛋白，离心后上清液进样。

　　色谱分析条件：以C18反相柱作分析柱，流动相组成为0.005mmol/L四丁基氢氧化铵—乙腈（825∶175，V/V），磷酸调整pH至5.0，流速为1.0mL/min，在紫外检测器230nm进行检测。本法的头孢哌酮和舒巴坦的最低检出浓度分别为10mg/L和5mg/L，至少在10～1000mg/L范围内呈线性，头孢哌酮和舒巴坦的绝对回收率分别是99.4％～102.9％和95.0％～105.3％，批内和批间RSD分别是1.4％、1.5％和1.8％、1.9％。对10种临床常用的β-内酰胺类药物进行干扰实验，未发现有干扰峰。β-内酰胺酶的产生已迅速波及到许多种类的细菌并且已经成为影响β-内酰胺类抗生素的主要威胁，以至许多头孢菌素对产β-内酰胺酶的细菌并不具有“深谱”抗菌能力，舒普深（Sulperazon）内含舒巴坦钠和头孢哌酮钠；由于舒巴坦（Sulbactam）是一种强有力的β-内酰胺酶抑制剂，而头孢哌酮（Cefoperazone）是第三代头孢菌素类抗生素，具有广谱的抗菌作用，两者联合具有明显的协同作用，是一种全新的广谱加上深谱的头孢菌素类抗生素，在临床治疗中广泛使用。但如果用药不当会产生副作用或未达到合理用药的目的。因此，测定血液中该药物的浓度，对于研究不同疾病条件下该药物的作用机理、药代动力学以及制定合理的给药方案十分必要。用高效液相色谱法测定舒巴坦和头孢哌酮的方法已有很多报道，但绝大多数方法是在一个色谱条件下测定一种药物，为此，笔者建立了一种能同时测定血清头孢哌酮和舒巴坦含量的高效液相色谱法。该法在保证足够的灵敏度、精密度和准确度的前提下，达到操作简便、节约有机溶剂、节省人力和时间的目的。

　　1、测定原理

　　以外标法为基础，血清样品经甲醇沉淀蛋白，取上清液过滤，滤液直接进样，用C18反相柱进行色谱分析，紫外检测器在230nm波长下进行检测，以峰面积定量。

　 2、材料和方法

　　2.1 标本的收集和保存抽取血液放入普通玻璃试管中（勿溶血），分离血清后立即测定，如不能立即测定应将血清密封，置4℃冰箱或-20℃下保存，一周内测定。

　　2.2 仪器高效液相色谱仪：包括Waters510泵，486紫外可见光检测器，U6K进样阀，PC800色谱工作站，AST486微机。平头微量注射器：Hamilton25μL，美国。样品过滤器：NewHydePark，日本。样品过滤膜：Millipore0.5μm，美国。离心沉淀机：LXJ—Ⅱ型，南京第一医疗器械厂生产。

　　2.3 试剂标准物：头孢哌酮（纯度为93.8％）和舒巴坦（纯度为99.5％）均由中国大连辉瑞制药有限公司提供。溶剂：四丁基氢氧化铵和磷酸为国产分析纯试剂；乙腈和甲醇为国产色谱试剂；水为Millipore超纯水器生产。

　　2.4 溶液配制

　　标准液：室温下分别配制浓度为1g/L的头孢哌酮和舒巴坦的甲醇溶液，密封。置4℃冰箱保存，用前取出放至室温后使用。血清标准应用液：参考舒普深血清药代动力学资料，确定两药物标准曲线各点的血清药物浓度（表1）。用健康正常人无药混合血清配制。将不同浓度的血清标准应用液分装，密封，置-20℃保存，至少在二周内是稳定的。

　　2.5 样品预处理取所需数目的6mL圆底带塞试管，于试管中分别加入标准血清应用液、空白无药血清和病人标本各0.5mL。于各管中准确加入甲醇0.5mL，旋涡1min，离心（3000r/min）15min。吸取上清液过滤，取滤液20μL进样。

　　2.6 色谱分析条件分析柱：Nova-PakR○C184μm，3.9mm×150mm，检测波长：UV230nm，流速：1.0mL/min。柱温：室温。

　　2.7 计算在PC800色谱工作站中设置好各有关参数，得出头孢哌酮和舒巴坦的血清标准物的峰面积。以各药标准血清的峰面积为纵坐标，其相应的血药浓度为横坐标，分别绘制各药的标准曲线。由待测标本的峰面积，在标准曲线上查出其相应的血药浓度。亦可根据各药的峰面积与血药浓度的回归方程，计算标本的血药浓度。

　　3、结果

　　3.1 检出限以引起两倍于噪音的药量为最低检出量，以经预处理后的进样药量等于最低检出量的标本药物浓度为最低检出浓度。本法的最低检出浓度分别是：头孢哌酮为10mg/L，舒巴坦为5mg/L。

　　3.2 干扰实验在上述色谱条件下，对10种临床常用的β-内酰胺类药物（氨苄青霉素、羟氨苄青霉素、青霉素G钠盐、氧哌嗪青霉素、克拉维酸、头孢噻肟、头孢他啶、头孢曲松、头孢唑啉、头孢呋辛进行了干扰实验，均未发现有干扰峰。

　　4、讨论

　　4.1 色谱体系的选择在分析碱性药物时，多采用反相柱，它可使血液中的内源性强极性成分快速洗脱下来，避免对测定药物的干扰，同时也缩短了测定时间，笔者采用了C18反相柱进行分离。固定相确定以后，流动相的组分对被测物的色谱分离起着决定性的作用，笔者曾试用甲醇（多种比例）作为流动相中的强溶剂，分离度和峰形均不令人满意，改用乙腈作为强溶剂和用四丁基氢氧化铵作为添加剂，且按照一定比例配制及调整pH，就获得了满意的分离度。

　　4.2 样品的预处理本法样品处理操作简单、快速，试剂易得，基本上能满足临床检测的要求，如需提高检测灵敏度，还需要将提取液进一步浓缩和重组，然后再进样分析，此有待进一步摸索改进。

　　4.3 方法概述和应用实例采用本实验所设计的流动相能将舒普深中头孢哌酮和舒巴坦完全分离，虽然舒巴坦中常含有碱性降解物，但它并不干扰本法含量测定；分离后虽然用外标法以峰面积计算出组分的含量。但由于样品处理过程简单，人为影响因素少，且通过多次实验证明本法的特异性强，灵敏度较高，重现性和回收率结果良好，另外，通过比较，无论是用峰面积或是峰高计算结果，均无明显差别。本方法建立以后，已对临床90多人次烧伤病人用药后的血清标本进行了测定，未发现内源性物质和药物的代谢产物的干扰，说明本法能够满足对舒普深临床血药浓度和药代动力学监测的要求。