标题奶粉中六种脂肪酸的测定

摘要：本实验室根据国家标准GB 5413.27—2010 《婴幼儿食品和乳品中脂肪酸的测定》中提供的方法对奶粉中的六种脂肪酸含量进行测定。这六种脂肪酸分别为月桂酸、肉豆蔻酸、γ-亚麻酸、α-亚麻酸、芥酸和花生四烯酸（ARA）。

实验中首先用有机溶剂对奶粉中的脂肪进行提取，然后再对提取的脂肪进行皂化生成游离的脂肪酸，最后在三氟化硼的催化下进行甲酯化反应。形成的脂肪酸甲酯用配有氢火焰离子化检测器的气相色谱仪进行分析，并进行外标法定量。

关键词：脂肪酸、皂化、三氟化硼、外标法

1 实验部分

1.1    试剂及标准溶液配制

石油醚：沸程 30 ℃～60 ℃。

乙醚：分析纯。

99.8% 无水乙醇：优级纯

正己烷：色谱纯。

氨水：25 %～28 %，分析纯。

氢氧化钾：分析纯。

甲醇：色谱纯。

三氟化硼甲醇溶液：质量分数为14 %。

饱和氯化钠溶液：溶解18 g 氯化钠于50 mL 水中，搅拌溶解，澄清备用。

0.5 mol/L氢氧化钾-甲醇溶液：称取2.8g 氢氧化钾，用甲醇溶解并稀释定容至 100 mL，混匀。

焦性没食子酸甲醇溶液（10 %）：将1.0 g 焦性没食子酸溶于10 mL 甲醇中配制成10 %焦性没食子酸甲醇溶液备用。

脂肪酸甲酯标准品：月桂酸甲酯、肉豆蔻酸甲酯、γ-亚麻酸甲酯、α-亚麻酸甲酯、芥酸甲酯和花生四烯酸甲酯，均购自百灵威试剂有限公司。

标样配制：按试样中各脂肪酸含量及所要分析脂肪酸的种类适当配制其浓度，正己烷定容并贮存于－10 ℃以下的冰箱中，有效期三个月。实验中脂肪酸甲酯标准贮备液和标准工作液按表1所示的浓度配制。

表1 脂肪酸甲酯标液配制浓度

1.2仪器及工作条件

恒温水浴：40 ℃～80 ℃

离心机：转速≥5000 转/分钟

分析天平：感量为 0.1 mg

旋转蒸发器

抽脂管：100 mL 磨口具塞试管，抽脂管干燥、恒重。

GC4000A 气相色谱仪

GC仪器条件：

色谱柱：PC-2560  100m×0.25mm×0.20μm； 汽化室温度：260℃； FID检测器温度：280℃； 载气：高纯N₂ ； 分流比：60:1； 柱流速：1mL/min； 进样量：1μL； 柱箱温度：初时温度140℃，保持5min后以4℃/min，升温至240℃，保持30min。

1.3样品处理过程

称取试样1.0 g（精确到0.1 mg）至抽脂管中，加入65 ℃ ±1 ℃的水10 mL 溶解试样，振摇，使样品完全分散。于上述试样中加入2 mL氨水，于65 ℃ ±1 ℃水浴锅中放置15 min，取出轻摇，冷至室温。

脂肪的提取：在制备好的样品中加入10 mL 乙醇，混匀。加入25 mL 乙醚，加塞振摇1 min。加入25 mL 石油醚，加塞振摇1 min，静置、分层，有机层转入磨口烧瓶中。再加入25 mL 乙醚及25 mL石油醚，加塞振摇1 min，静置、分层，有机层转入磨口烧瓶中，再重复操作一次。合并抽提液于磨口烧瓶中，用旋转蒸发仪浓缩至干。

皂化酯化：在浓缩物中加入1.0 mL 焦性没食子酸甲醇溶液。浓缩干燥之后再加入10 mL 氢氧化钾甲醇溶液置于80 ℃ ±1 ℃水浴上回流5 min～10 min。再加入5 mL 三氟化硼甲醇溶液，继续回流15 min，冷却至室温，将烧瓶中的液体移入50 mL 离心管中，分别用3 mL 饱和氯化钠溶液清洗烧瓶三次，合并饱和氯化钠溶液于50 mL 离心管，加入10 mL 正己烷，振摇后，以5000 转/分钟离心5 min，取上清液作为试液，供气相色谱仪测定。

2 结果与讨论

2.1    标准曲线

实验最后配制的反式脂肪酸标准工作液的浓度梯度如下：

表2  标准工作液浓度梯度

在上述仪器条件下，根据浓度和峰面积分别绘制六种脂肪酸甲酯的标准曲线，见图1至图7。其中，图1为标准液的色谱分离谱图。实验获得的六种脂肪酸甲酯在各自的工作液浓度范围内，浓度和峰面积都有良好的线性关系，它们分别的相关系数≥0.9992。

图1 标准液的色谱分离谱图

图2 月桂酸甲酯的校准曲线

曲线方程:Y = 134960.061152 X +0.0000

相关系数: : 0.9997

图3 肉豆蔻甲酯的校准曲线

曲线方程:Y = 127750.180003 X +0.0000

相关系数: : 0.9992

图4 γ-亚麻酸甲酯的校准曲线

曲线方程:Y = 107931.594661 X +0.0000

相关系数: : 0.9998

图5 α-亚麻酸甲酯的校准曲线

曲线方程:Y = 95870.460842 X +0.0000

相关系数: : 0.9993

图6 芥酸甲酯的校准曲线

曲线方程:Y = 89144.257336 X +0.0000

相关系数: : 0.9996

图7 花生四烯酸甲酯的校准曲线

曲线方程:Y = 80563.999173 X +0.0000

相关系数: : 0.9999

2.2    实际样品分析结果

按照上述的实验方法对两个奶粉样品分别进行脂肪酸的提取及甲酯化，并进行气相分析。根据奶粉样品中六种脂肪酸甲酯各自的峰面积，并结合各自的校准曲线，利用外标法进行定量分析，获得不同样品提取物中六种脂肪酸甲酯的浓度。

结果如表3所示。图8为1#样品的色谱分析谱图。

图8 1#样品色谱分析谱图

表3 样品提取物中六种脂肪酸甲酯的质量浓度

上述得到的结果是样品提取物中六种脂肪酸甲酯的质量浓度，根据这个结果再结合公式1即可计算出样品中六种脂肪酸的具体含量。计算结果如表4所示。

    公式1

式中：

X_i —— 样品中各脂肪酸的含量，单位为 mg/100g；

V —— 样品的定容体积，单位为 mL；

m —— 样品质量，单位为 g；

c_i —— 试样测定液中各脂肪酸甲酯的质量浓度，单位为 mg/mL；

F_i —— 各脂肪酸甲酯转化为脂肪酸的换算系数，参见附表1。

表4样品中六种脂肪酸的含量

附表1 各脂肪酸甲酯转换成脂肪酸的系数F_i

2.3精密度实验

在重复性条件下进行两次独立测定，根据测定结果，计算精密度。计算结果如表5所示。

表5 精密度实验结果

3 结论

本文采用气相色谱石英毛细柱外标法测定奶粉中的六种脂肪酸含量。实验中，六种脂肪酸甲酯在各自的浓度范围内都有良好的线性关系，相关系数r≥0.9992，仪器和方法均具有良好的重复性和稳定性。对2种奶粉样品进行了检测分析，得到了2种奶粉样品中六种脂肪酸相应的含量，并且两个独立实验得到的结果间的精密度小于15%，符合国标要求。