标题顶空气相色谱法杀菌剂残留分析

　10.1 有机硫杀菌剂
　　有机硫杀菌剂是指毒性基团或成型基中含有硫的有机合成杀菌剂，是最早研制的有机杀菌剂。有机硫杀菌剂具有高效、低毒、杀菌谱广、药害少、不易产生抗药性等优点。
　　按照已知的化学结构该类杀菌剂主要分为三种类型：
　　1. 二硫代氨基甲酸盐类衍生物：是最重要的一类有机硫杀菌剂，包括乙撑二硫代氨基甲酸盐类和二甲基二硫代氨基甲酸盐类，前者即代森类，主要有锌盐、锰盐和铵盐等，代表品种是代森锰锌等；后者即福美类，如福美铁、福美锌等；还有非盐的二分子二甲基二硫代氨基甲酸氧化物，如福美双等。
　　2. 三氯甲硫基类：含有三氯甲硫基的多种衍生物，如酰胺、酰羟铵、酰肼、醇类、酚类、硫醇类、硫酚类、磺酰胺类、硫代磺酸类、杂环类等。其中酰胺类最重要，主要的品种有克菌丹和灭菌丹。
　　3. 氨基磺酸盐和取代苯磺酸类，如氨基磺酸钠、敌锈钠等。
　　10.1.1 乙撑二硫代氨基甲酸盐类杀菌剂
　　乙撑二硫代氨基甲酸盐类（Ethylenebisdithiocarbomates, EBDCs），即代森类杀菌剂，是一类广泛使用的保护性杀菌剂，其主要品种有代森锰（maneb）、代森锌（zineb）、代森锰锌（mancozeb）、代森钠（nanbam）、代森铵（amobam）、代森环（milneb）等。最常用的品种为代森锰锌。
　　该类杀菌剂主要用于防治果树、蔬菜、西瓜等作物的叶斑病、叶霉病、霜霉病、炭疽病等。从残留角度，人们关心其在蔬菜、水果及其在土壤环境中的残留。由于该类药剂几乎没有内吸作用，使用后主要残留在植物体表面，因此，残留提取比较容易。
　　该类杀菌剂的杂质及其在环境中的降解产物乙撑硫脲（ethylenethiourea, ETU），引起试验动物甲状腺瘤，具有致癌性、致突变性和致畸性，因此乙撑二硫代氨基甲酸盐类杀菌剂的安全问题受到高度重视。
　　1．顶空气相色谱法
　　目前代森类杀菌剂的残留量以CS2来表示。因此，此类杀菌剂的残留测定的是CS2的含量。一般采用顶空气相色谱法进行测定。
　　⑴. 测定原理
　　在密闭容器内代森类杀菌剂与反应分解生成二硫化碳并全部汽化进入反应瓶上部空间的气相之中，通过测定反应瓶中液－气平衡状态下，气相中二硫化碳的量来确定代森类农药的残留量。
　　⑵. 样品处理
　　称取一定量（50g）经过粉碎的蔬菜、水果、土壤、粮食样品或量取一定体积的水样于反应瓶中，反应瓶可用250mL的医用葡萄糖注射液瓶代替（密封要好）。加入一定量（3g）的氯化亚锡（还原剂）和一定量的10％的盐酸溶液，立即加塞密封。将反应瓶于70℃恒温水浴中反应2h（反应中要经常检查气密性），取出反应瓶置40℃水浴中恒温待测。用注射器吸取反应瓶上部空间气体，进行气相色谱测定。
　　二硫化碳标准曲线的制定：每次开机气相色谱测定时均需要制作标准曲线，并达到线性回归要求才能使用。于反应瓶中加入与样品数量相同体积或重量的蒸馏水，及一定数量的二硫化碳标准溶液，其余步骤同样品测定。
　　⑶. 气相色谱测定
　　色谱条件一：SP7800型气相色谱仪 ECD检测器，1.8m×3mm玻璃柱，20% OV–101/Gas Chrom Q 100～120目。色谱柱温度50℃、检测器200℃，进样口100℃。氮气（>99.999%）11.6mL/min，tR：1min45s（CS2）。最小检测量：2×10-11g。
　　色谱条件二：SP7800型气相色谱仪 NPD检测器，2m×3mm玻璃柱，2%QF-1+1.5% OV-17/Gas Chrom Q 80～100目。色谱柱温度80℃、检测器145℃，进样口120℃。氮气（>99.999%）20mL/min，空气15mL/min，氢气 10mL/min 。tR：29s（CS2）。最小检测量：1.125×10-10g。
　　色谱条件三：SP7800型气相色谱仪 FPD检测器，2m×3mm不锈钢柱，5%SE-30／101白色酸洗担体，177～149μm （80～100目）。色谱柱温度65℃、检测器150℃，进样口120℃。氮气（>99.999%）25mL/min，氢气85mL/min，空气90mL/min。tR：1min（CS2）。最小检测量：5×10-10g。
　　色谱条件四：SP7800型气相色谱仪 FPD检测器，2.1m×3mm不锈钢柱，5%SE-30/GCS 880 AW DMCS,80～100目。色谱柱温度65℃、检测器150℃，进样口150℃。氮气（>99.999%）25mL/min，氢气88.3kPa，空气127.5kPa。tR：0.95min（CS2）。最小检测量：2×10-10g。
　　色谱条件五：GC- FPD-S，2m×3mm不锈钢柱，15%OV-101/Gas Chromsorb W AW DMCS（80～100目）。色谱柱温度60℃、检测器150℃，进样口120℃。氮气（>99.99%）15mL/min，氢气160mL/min，空气140mL/min及70 mL/min。tR：1min（CS2）。最小检测量：1.8×10-10g。
　　2．乙撑硫脲残留测定方法
　　乙撑硫脲（ETU）的残留分析方法有许多，主要有GC、HPLC、TLC测定，其中以GC测定为主。由于乙撑硫脲（ETU）的极性非常强，蒸气压极低，难以用气相色谱法直接进行测定，主要是由于色谱峰严重拖尾和检测灵敏度达不到残留分析的要求。目前主要采用衍生后气相色谱测定或用高效液相色谱法，一般HPLC的灵敏度往往不如GC高，所以采用衍生后GC测定的比较多。
　　气相色谱法
　　⑴．乙撑硫脲的衍生方法
　　乙撑硫脲的气相色谱测定需要进行衍生化，衍生方法主要有以下几种：
　　①. 采用苄氯（benzyl chloride）和三氟乙酸酐（thifuoroacetic anhydride）进行衍生。
　　首先使ETU与苄氯回流反应，反应液经提取和重结晶得熔点为60~70℃的S-苄基ETU（S-benzyl ETU），以S-苄基ETU做为标准物质进行定性和定量。在分析残留样品时，用甲醇提取ETU。使提取液与苄氯回流反应为S-苄基ETU，并净化和浓缩，然后使S-苄基ETU与三氯氟乙酸酐反应，反应物以GC-ECD测定，衍生过程见图10-1所示。
　　图10-1 苄氯衍生ETU反应
　　此方法将F原子引入，在ECD检测时灵敏度较高。用该方法测定苹果中ETU残留，添加浓度为0.0103~1.03mg/kg 时，ETU的平均回收率为94.7±5.9%，样品的最小检测浓度达到0.005mg/kg。
　　②. 采用1-溴丁烷对ETU进行衍生。
　　在衍生时加入二甲基酰胺（dimethyformamide，DMF）和氢硼化钠（sodium borohydride）以促进衍生反应的进行。衍生后得S-丁基ETU，用GC-FPD-S进行测定。衍生反应式见图10-2。
　　图10-2  1-溴丁烷衍生ETU反应
　　用此方法对苹果、香蕉、马铃薯和西红柿中的残留量进行测定，添加0.01~1.0 mg/kg ETU的回收率为61±13%~85±1%，样品中ETU最小检出浓度小于0.01 mg/kg。
　　③. 采用苄氯（benzyl chloride）和五氟苯酰氯（pentalfluorobezoyl chloride）衍生。
　　有人认为在第一种衍生方法中，存在回收率不稳定，而且对照样品中有干扰峰出现。所以提出用五氟苯酰氯（pentalfluorobezoyl chloride）代替第一种方法中的三氟乙酸酐。该方法的反应过程见图10-3所示。
　　图10-3  S-苄基ETU五氟苯酰化反应
　　用此方法对大豆、苹果、菠菜中的ETU残留分析进行了研究，添加0.01~1.28mg/kg ETU的回收率为93%~114%，样品最小检出浓度为0.005 mg/kg。
　　④. 用间-三氟甲基苄氯与ETU反应得S-间-三氟甲基苄基ETU（产物Ⅰ），产物（Ⅰ）可进一步与三氟乙酸酐反应得产物（Ⅱ），两种产物均可用GLC-ECD进行测定，反应过程见图10-4所示。
　　图10-4  间-三氟甲基苄氯与ETU衍生反应示意图
　　产物（Ⅱ）比产物（Ⅰ）的灵敏度有所提高。此方法对大豆、苹果、马铃薯和西红柿中添加0.01~1.0 mg/kg ETU的回收率为92.5±4.6%，最小检出浓度为0.002 mg/kg。
　　目前，在众多衍生方法中以用苄氯或苄溴衍生的最多，从化学结构上看苄溴更容易与ETU进行衍生。
　　⑵. 乙撑硫脲的残留分析：衍生气相色谱法
　　国内分析乙撑硫脲残留的常用衍生气相色谱法有以下几种：
　　方法一：
　　该方法采用溴化苄衍生后GLC－FPD-S测定，方法原理如下：
　　①. 硫苄基乙撑硫脲（S-ETU）的制备：取0.5gETU，加入溴化苄1.0mL，加入无水乙醇，回流反应30min，用50mL 二氯甲烷转入分液漏斗，加入1M的盐酸20mL及50mL水，振荡分层，弃去下层。上层加入20mL10％的NaOH溶液，振荡后加入50mL苯，充分振荡后静置分层，弃去下层。上层转入另外分液漏斗中，用50mL苯再提取1次；上层经无水硫酸钠脱水后注入烧瓶中，浓缩结晶。此结晶再重结晶2次得熔点为68～69℃的S-ETU结晶。
　　②. 样品处理：取50g样品，于碘量瓶中，加入50mL水及100mL无水乙醇，振荡提取30min，减压过滤，准确量取100.0mL滤液于250mL烧瓶中，加入浓度为10-4g/mL的溴化苄溶液2mL，回流反应30min，冷却后用100mL水转入分液漏斗中，加入1M HCI 5mL，振荡后加入50mL二氯甲烷，充分振荡后静置分层，弃去下层，上层再用二氯甲烷提取1次，方法同上。加入10％的NaOH 5mL于上层溶液中，振荡后分别用50mL二氯甲烷提取3次，二氯甲烷经过无水硫酸钠脱水后注入烧瓶，浓缩后GC-FPD-S测定。
　　③. 气相色谱测定：SP7800型气相色谱仪 FPD检测器，2m×3mm玻璃柱，7% OV-17/Gas Chrom Q 80～100目。检测温度，柱温230℃，检测器230℃，进样口250℃。载气：氮气 160 mL/min，空气150 mL/min及70 mL/min，氢气160mL/min。保留时间：1 min55s。
　　此方法的最小检出量：1.25×10-10g，添加0.05、0.1和1.0 mg/kg 3个浓度ETU的回收率在96.86±5.71%～98.68±3.26％。
　　方法二：
　　①. 样品处理：称取50g植物样品（蔬菜或水果，经捣碎）、土壤（粉碎）样品，置于250mL三角瓶中，加50mL水，100mL乙醇，振荡30min，减压抽滤。取100mL滤液置250mL烧瓶中，加2mL 1.443×10-4g/mL 溴化苄乙醇溶液，回流反应30min。冷却后用100mL水转入分液漏斗中，加5mL1mol/L盐酸，振荡后用2×50mL二氯甲烷提取，收集二氯甲烷提取液。再加入5mL 10% 氢氧化钠溶液于上层中，振荡后用3×50mL二氯甲烷萃取，合并提取液经无水硫酸钠脱水，浓缩，定容后待测。
　　②. 气相色谱法测定：SP7800型气相色谱仪NPD检测器，2m×3mm玻璃柱，2%QF-1+1.5% OV-17/Gas Chrom Q 80～100目。检测温度  柱温245℃，检测器245℃，进样口260℃。载气：氮气 20 mL/min，空气15 mL/min，氢气8mL/min。保留时间：1 min24s。
　　该方法测定香蕉和土壤中乙撑硫脲，添加0.05～1mg/kg，回收率为89.2%～98.2%，最小检出量：6.82×10-10g，最小检出浓度：0.014mg/kg。
　　高效液相色谱法
　　方法一 ：
　　①. 样品处理：
　　番茄提取：取50.0g番茄样本于组织捣碎机内,加75mL水,捣碎后迅速用氨水调整匀浆液pH11～12，同时加入5g氯化钠、5g Celite545和100mL乙醇，再混合匀浆2min以上，用布氏漏斗过滤，甲醇少量分多次冲洗样品缸和布氏漏斗，必要时调整过滤液pH7～9，定容250mL。取定容溶液25mL于100mL蒸发瓶中加入2滴1%癸醇丙酮溶液，在30℃条件，减压浓缩至约8mL，取下往蒸发瓶中加入10g 102白色酸洗担体，迅速剧烈的震荡，直到全部团块散开。向蒸发瓶内加75mL淋洗液乙醇/三氯甲烷（4/96, v/v），摇匀。
　　土壤提取：称取50.0g土壤样品于碘量瓶内，所加溶液同番茄，在电动振荡机上振荡提取2h，其余步骤同番茄。
　　柱层析净化：将担体悬浮液倒入氧化铝层析柱中，层析柱内装5g已活化的氧化铝，柱下500mL蒸发瓶内装10mL水和6滴25%癸醇丙酮溶液。待75mL淋洗液的液面接近102白色担体时，再用200mL淋洗液分4次冲洗蒸发瓶和层析柱。待淋洗液自然滴干后按上述减压蒸馏条件浓缩淋出液约2～3mL，停止浓缩加水定容5mL，待测。
　　②. 高效液相色谱法测定：LC2100型液相色谱仪，紫外检测器（UV，波长233nm）。色谱柱：25cm×4.6mm）不锈钢柱，内装Spherisorb 5μ-C18。流动相：甲醇／水 （95/5,V/V）。柱温：40℃。流速：0.5mL/min。保留时间：约8min。该方法最小检出量：1×10-9g，番茄和土壤中添加乙撑硫脲0.04～0.10mg/kg，回收率为88.9%～89.2% ，土壤中添加0.05～0.10mg/kg ，回收率为85.0%～91.3%。
　　方法二：
　　①. 样品处理：
　　提取：称取20g样品置于250mL具塞三角瓶中，加入80mL甲醇，振荡提取30min。提取液用布氏漏斗经玻纤滤膜抽滤，并用30mL甲醇分多次洗涤三角瓶及滤渣，合并滤液。将合并后的提取液倒入250mL分液漏斗中，用80mL，60mL，60mL石油醚振摇洗涤三次，每次1min，静置分层后，弃去石油醚相。将甲醇提取液在旋转蒸发器上（≤40℃）浓缩至约10mL。
　　液-液分配净化：将上述浓缩提取液转移至250mL分液漏斗中，用15mL水分数次清洗浓缩瓶，并转移至分液漏斗中。加入20gKF·2H2O和0.6g氯化铵，振摇使完全溶解。用100mL×2二氯甲烷/甲醇（9:1,V/V）提取两次，每次1min，合并萃取液并经无水硫酸钠过滤入250mL圆底烧瓶中，在旋转蒸发器上（≤40℃）浓缩至1～2mL。土壤样品可省去提取步骤，只将石油醚洗涤后的提取液经浓缩至干，并用少量淋洗液溶解后直接进行柱净化。
　　柱层析净化：在30cm（长）×1.8cm（内径）玻璃层析柱中，依次装入4cm厚无水硫酸钠，4g弗罗里硅土，4g混合净化剂及3～4cm厚无水硫酸钠，在混合净化剂与下层的弗罗里硅土和上层的无水硫酸钠之间可用少量脱脂棉分隔开。用25mL淋洗液预淋净化柱，然后将上述浓缩液转移到柱中，用少量淋洗液多次洗涤圆底烧瓶并转入柱中，再用淋洗液淋洗，弃去前10mL，收集后50mL淋出液。将所收集的淋出液转移到100mL圆底烧瓶中，并用旋转蒸发（≤40℃）浓缩至干，用流动相甲醇/水（30:70,V/V）定容至4mL，并用Millipore专用滤膜滤器过滤后待测定。
　　②. 高效液相色谱测定：LC2100型液相色谱仪，色谱柱：Kromsil 25cm×4.6mm C18柱；温度：室温；流动相：甲醇／水（30:70,V/V）；流速：0.4mL/min。波长：254nm，保留时间：7.5min。该方法最低检出浓度：0.02mg/kg；回收率：添加乙撑硫脲0.05～10.00mg/kg的回收率在83.2%～90.7%。
　　10.1.2 二甲基二硫代氨基甲酸盐类杀菌剂
　　该类杀菌剂重要的品种有铵盐、锌盐、铁盐等，目前在我国使用的主要是砷盐中的福美砷和氧化物福美双（thiram）。以福美双为例介绍其在土壤及植物体内的残留分析方法。
　　1. 方法原理
　　样本用丙酮－甲醇混合液提取，二氯甲烷液－液分配，弗罗里硅土－活性炭柱层析净化，高效液相色谱法（UV）测定的残留测定方法。
　　2. 样品处理
　　⑴. 提取
　　土壤：称取10g样品，加50mL丙酮/甲醇（1:1,V/V），振荡提取2h，然后用装有无水硫酸钠的漏斗过滤，滤渣用150mL 丙酮／甲醇（1:1,V/V） 溶液冲洗三次，置于旋转蒸发器上浓缩滤液到一定体积，加入已配好的内标物萘，萘的体积是滤液浓缩体积的1/2，最后用甲醇／丙酮（10:1,V/V）定容，待测。
　　小麦籽粒：称取5g样品，加50mL丙酮／甲醇（1:1,V/V），振荡提取2h，用30g无水硫酸钠的漏斗过滤，滤渣用150mL丙酮／甲醇（1:1,V/V）溶液冲洗三次，用旋转蒸发器浓缩到约2mL。
　　鲜植株：称取25g鲜植株，切碎，加75mL丙酮，振荡提取2h，用波氏漏斗过滤，残渣用50mL二氯甲烷分三次洗涤，滤液转移到分液漏斗中，加30mL 3%氯化钠水溶液，用3×50mL二氯甲烷萃取，合并萃取液，浓缩至约2mL。
　　⑵. 柱层析净化
　　籽粒：层析柱中依次装入2cm厚无水硫酸钠，6g弗罗里硅土（80～100目，用前130℃烘5h，冷却后加5%水减活），1g活性炭（颗粒活性炭，层析用，盐酸洗，煮沸1h，冷却后洗至中性），2cm厚无水硫酸钠，将浓缩物转移到层析柱中，用150mL丙酮/甲醇（1:1,V/V）混合液淋洗并收集淋出液，然后浓缩到一定体积，按提取方法中的加萘方法加入一定量的萘，用甲醇/丙酮（10:1,V/V）溶液定容，待测。
　　植株：层析柱中依次装入2cm厚无水硫酸钠，6g弗罗里硅土，2g活性炭，1g助滤剂，2cm厚无水硫酸钠，用150mL二氯甲烷淋洗并收集淋出液，浓缩到一定体积，按前面方法计算加入萘的量，加入萘，用甲醇/丙酮（10:1,V/V）溶液定容，待测。
　　3. 高效液相色谱测定
　　检测器：uv2100紫外检测器（UV，波长254nm）；色谱柱：20rbax ODS柱，0.25m（长）×4.6mm（内径）不锈钢柱；流动相：用等级梯度流动相，50/50（甲醇／水）2min，55/45（甲醇／水）3 min，60/40、2 min，65/35、1 min，70/30、5 min，50/50、2 min；柱温：45℃；保留时间：7 min12s。该方法的最小检出量：4.9×10-10g；最低检出浓度：0.025mg/kg；回收率：添加0.5～2.5 mg/kg的回收率植株为75.5%～93.0%；添加2.5 mg/kg，土壤回收率为88.3% ，籽粒为97.4%；变异系数：植株为6.5%～8.5% ，土壤为11.8% ，籽粒为11.4% 。
　　10.1.3 三氯甲硫基类杀菌剂
　　以该类杀菌剂的主要品种克菌丹（captan）为例，介绍其残留分析方法。
　　1. 样品处理
　　⑴. 提取
　　水果、蔬菜类：样品置于组织捣碎机中高速捣碎后，称取该样品20.0g于250mL具塞三角烧瓶中，加入100mL石油醚/丙酮（4/1, V/V），振荡30min。用布氏漏斗抽滤，以每次20mL的石油醚洗涤残渣，洗涤2次，滤液合并于500mL分液漏斗中。再以每次50mL 4%的硫酸钠水溶液洗涤，洗涤2次，以除去丙酮。上层石油醚经无水硫酸钠柱脱水收集于250mL烧瓶中，用10mL石油醚洗涤分液漏斗及无水硫酸钠柱,在旋转蒸发器上浓缩至约5mL。
　　油脂类：准确称取3.0g油样，于100mL烧杯中，加入20 mL正己烷溶解油样，将油样移至250 mL分液漏斗中，再用15 mL正己烷分数次洗涤烧杯并转至分液漏斗中，加35 mL经正己烷饱和的乙腈，振荡1min，静置分层。将下层液放置于另一500 mL分液漏斗中，加入100 mL 4%的硫酸钠水溶液和100 mL正己烷，再将250 mL分液漏斗中的正己烷层用乙腈（经正己烷饱和）提取3次，每次用乙腈25 mL，将乙腈提取液合并至500 mL分液漏斗中，轻轻振摇1 min，农药则转移至正己烷中，静置分层,弃去水相。分别用50 mL4%的硫酸钠水溶液洗涤正己烷层两次,弃去水相，正己烷层经无水硫酸钠柱脱水收集于250 mL烧瓶中，用10 mL正己烷洗涤分液漏斗及无水硫酸钠柱,在旋转蒸发器上浓缩至约5 mL。
　　⑵. 净化
　　在2cm×25cm玻璃层析柱中的底部加少许玻璃棉，再依次加入1cm高无水硫酸钠，5g弗罗里硅土（60～80目，650℃灼烧6h，冷却后贮于密闭容器内备用，使用前于130℃下活化5h）和1cm高无水硫酸钠。先以40 mL无水乙醚/石油醚（15/85, v/v）（对油脂样品，用无水乙醚/正己烷，15/85, v/v,下同）预洗层析柱，弃掉淋出液。把浓缩的样品液移入柱内，以每次5 mL的石油醚或正己烷洗样液浓缩瓶，洗涤2次，一并移入层析柱，最后以200 mL上述无水乙醚-石油醚或无水乙醚-正己烷洗脱，收集全部洗脱液，于40℃水浴上减压蒸至约40 mL，以石油醚或正己烷定容至50 mL，供色谱分析。
　　2. 气相色谱测定
　　色谱柱：OV-101，30m×0.53mm×1.0μｍ弹性石英毛细管柱；载气：高纯氮气，线速度：100℃时42cm/s；柱前压：75kPa，恒压方式；尾吹N2：60 mL/min；进样温度：250℃，检测器温度：300℃；采用不分流进样方式，进样量1?L，进样0.75min后吹扫。柱温升温程序：100℃下恒温4min，然后以8℃/min的速率程序升温至240℃，继续恒温至样品全部流出（约20min）。该方法在油脂及果蔬中添加50、100、150?g/kg的回收率为84.6％～97.6％，取样20.0g，定容5mL，进样1?L的最小检出浓度为10.0?g/kg。
　　10.2  有机磷杀菌剂
　　10.2.1 概述
　　有机磷类杀菌剂具有药效高、用途广、易分解和低残留的特点，其作为杀菌剂使用始于二十世纪六十年代，具有很好的内吸性。有机磷杀菌剂主要有三类：
　　1. 硫代磷酸酯类，又包括两类硫赶型磷酸酯和硫逐型磷酸酯。稻瘟净（EBP）、异稻瘟净（IBP）和敌瘟磷（edifenphos）是常见的硫赶型磷酸酯类杀菌剂。硫逐型磷酸酯的代表品种是甲基立枯磷（tolclofos-methyl）。
　　2. 磷酰胺类有机磷杀菌剂，常用的品种是三唑磷胺。
　　3. 金属有机磷化合物，目前这类有机磷杀菌剂只有三乙磷酸铝（phosethyl-AI）。
　　本节以敌瘟磷为例，介绍其残留分析方法。
　　10.2.2 敌瘟磷的残留分析
　　1. 方法原理
　　该方法中样品用丙酮提取，二氯甲烷液――液分配，弗罗里硅土柱层析净化，气相色谱法（FPD）测定。
　　2. 样品处理
　　⑴. 提取
　　粮食：称20g稻米粉，（10g稻壳、植株）放入250mL三角瓶中，加20mL水，80mL丙酮浸泡过夜，振荡提取2h，用快速滤纸过滤，滤渣用130mL丙酮分多次淋洗，合并丙酮提取液，在60℃水浴中减压蒸去丙酮。
　　土壤：称60g土壤，加水30mL，丙酮100mL，振荡提取2h，用布氏漏斗加10g Celite545助滤剂抽滤，滤渣再用60mL丙酮浸提并振荡1h，合并两次滤液，在60℃水浴中减压蒸去丙酮。
　　水：量取50mL水，放入250mL分液漏斗中，加15mL氯化钠，用3×25mL二氯甲烷提取。合并二氯甲烷液，在50℃水浴中减压浓缩至1～2mL。
　　⑵. 净化
　　液-液分配：将上述的提取浓缩物，转入250mL分液漏斗中，加4g氯化钠，25mL饱和氯化钠水溶液用3×25mL二氯甲烷提取。合并二氯甲烷液，在50℃水浴中减压浓缩至1～2mL。
　　柱层析：层析柱中依次装入2cm厚无水硫酸钠，15g弗罗里硅土（60～80目，140℃烘8h用前用5%水脱活），2cm厚无水硫酸钠。用正己烷湿法装柱。然后将上述浓缩液用气流吹干，再用少量正己烷把残留物转到层析柱中。用乙醚／正己烷（6:4,V/V）混合液淋洗，弃去前15mL淋出液，收集后95mL淋出液，在50℃水浴中减压浓缩至1～2mL后，再用N2流吹干，用正己烷定容后待测。
　　3. 气相色谱测定
　　检测器：火焰光度检测器（FPD-P）；色谱柱：150cm（长）×3.2mm（内径）玻璃柱；担体：Chromsorb W HP,80～100目；固定液：10%OV-3；检测温度：色谱柱260℃，检测器280℃，进样口280℃；载气：氮气（≥99.99%），80mL/min；燃烧气：氢气72mL/min，空气52mL/min。保留时间1min。该方法的最小检出量：2.4×10-10g；最低检出浓度：粮食为0.02mg·kg-1，稻壳及植株为0.04 mg·kg-1，土壤为0.01 mg·kg-1 ,水为0.05 mg·L-1；回收率：添加0.1~0.5 mg·kg-1，粮食回收率为86.3%，植株81.3%，稻壳89.4%，土壤94.2%，田水91.0%。变异系数：稻米为8.0%，稻壳、植株为4.9%、6.0%。土壤及田水为10.2%和3.0%。
　　10.3 取代苯类杀菌剂
　　10.3.1 概述
　　取代苯类化合物的结构特征是以苯核为母体，品种较复杂，没有明显的系统性。重要品种如：百菌清（Chlorothalonil）、五氯硝基苯（PCNB）等。
　　在残留分析中，该类杀菌剂结构中多含有Cl原子，因此测定时可以考虑用GC－ECD进行。本节主要以百菌清为代表介绍其残留分析方法。
　　10.3.2 蔬菜、水果中百菌清的残留分析
　　1. 方法原理及适用范围
　　样品中的百菌清经提取、净化后用具有电子捕获检测器的气相色谱仪测定，与标准比较定量。百菌清含有电负性较强的氯原子，选用电子捕获检测器定量测定。折算出百菌清的含量。本方法适用于百菌清在蔬菜和水果中的残留分析。
　　2. 样品处理
　　⑴. 提取：
　　称取25g黄瓜匀浆，置于250mL锥形瓶中，加60mL丙酮及50％磷酸2mL，充分振摇2min，过滤，用20mL丙酮洗涤锥形瓶2次，滤液全部移入250mL分液漏斗中，并加入2％硫酸钠溶液100mL，摇匀后用环己烷60mL提取三次，静置分层后，提取液经无水硫酸钠漏斗干燥，减压浓缩至5mL待净化。
　　⑵. 净化
　　将层析柱底部垫少许脱脂棉，依次装入2cm无水硫酸钠，7g弗罗里硅土，2cm无水硫酸钠，敲实并成一平面。然后用15mL环己烷预淋层析柱，弃去预淋液。将浓缩的样品提取液倒入柱中，用100mL环己烷－丁酮（20:1）混合液分4次淋洗，收集全部淋洗液，浓缩后定容，进行气相色谱分析。
　　3. 气相色谱测定
　　长1.5m、内径3mm的玻璃柱。填装涂有1.5％OV-210的Chromosorb W HP（80～100目）；柱箱194℃，检测器255℃，汽化室260℃；高纯氮流速30mL/min。保留时间为3min41s。该方法的最小检出量为1.2×10-12g，最小检出浓度为0.048mg/kg，黄瓜添加0.1、1.0、5.0 mg/kg的回收率为80.8％～86.3％。
　　10.3.3 百菌清及4-羟基百菌清的残留分析
　　1. 方法原理
　　样品用酸性丙酮提取，乙醚提取，弗罗里硅土柱层析净化，气相色谱法测定百菌清。与3-甲基-1-p-甲苯三氮烯甲基化反应，酸性氧化铝柱层析净化后，气相色谱法测定4-羟基百菌清。
　　2. 样品处理
　　⑴. 提取
　　称取50g番茄匀浆液或土壤，放入300mL具塞三角瓶中，加入150mL酸化丙酮（丙酮／硫酸／水，51:1:1，V/V/V），置于振荡器上振荡2h，放置过夜，用布氏漏斗抽滤，用20mL丙酮洗涤瓶和残渣3次，合并滤液和洗液，减压浓缩丙酮残余物用0.4mol/L硫酸氢钠水溶液和稀硫酸调至pH4.5。定量转移到500mL分液漏斗中，加入3×50mL石油醚剧烈振荡以提取百菌清。水相转移至另一分液漏斗中，石油醚相在旋转蒸发器上浓缩近2mL，再用空气吹至微干。残留物用淋洗液A（石油醚/二氯甲烷，4:1，V/V）溶解，并定容至25mL。
　　水相中加入15mL硫酸（浓硫酸／水，1:1,V:V），调节pH至＜2，用3×50mL石油醚／乙醚（1:1，V/V）混合醚提取4－羟基百菌清，浓缩提取液至微干，加10mL甲醇／盐酸（3:1，V/V），再加入5mL3-甲基-1-p-甲苯三氮烯的乙醚液（0.1g 3-甲基-1-p-甲苯三氮烯溶于5mL乙醚中），放置30min，吹尽乙醚，残留物用5mL二氯甲烷溶解。
　　⑵. 净化
　　百菌清：层析柱底塞入脱脂棉，然后依次装入1.5cm厚无水硫酸钠，2g弗罗里硅土，1.5cm厚无水硫酸钠。用10mL石油醚预淋，弃去淋出液。用移液管准确吸取1mL样品提取液（相当于2g样品）于层析柱中，先用30mL洗液A淋洗，弃去淋出液，再用30mL淋洗液B（正己烷/二氯甲烷/乙腈，9.7:10:0.3，V/V/V）淋洗，并收集在50mL磨口三角瓶中，减压浓缩至微干，甲苯定容，待测。
　　4-羟基百菌清：层析柱下部塞入脱脂棉少许，然后依次装入1.5cm厚无水硫酸钠，4g酸性氧化铝，1.5cm厚无水硫酸钠。用10mL二氯甲烷预淋，弃去淋出液，将5mL含有样品的二氯甲烷溶解物转移到柱中，瓶子用5mL二氯甲烷洗二次，洗液也移至柱中，然后再用30mL二氯甲烷淋洗，收集淋出液，浓缩至微干，用甲苯定容，待测。
　　3. 气相色谱测定
　　sp7800气相色谱仪，电子捕获检测器（ECD，Ni63）；色谱柱：2m×3mm玻璃柱；担体：Chromosorb W AM DMCS，80~100目；固定液：1.6％OV-17+6.4％OV-210；检测温度：色谱柱200℃，检测器250℃，进样口225℃；载气：高纯氮气60mL/min；保留时间：百菌清为7min，4-羟基百菌清为8min24s。该方法的最小检出量：百菌清为1.2×10-11g，4-羟基百菌清为2.5×10-11g；最低检出浓度：百菌清为0.002mg/kg，4-羟基百菌清为0.005mg/kg。添加百菌清0.05~5.0 mg/kg，番茄回收率为85.0~95.9％，土壤为75.3~90.4％。添加4-羟基百菌清0.0025mg/kg，番茄回收率为87.6~92.4％。
　　10.4  杂环类杀菌剂
　　10.4.1 概述
　　杂环类杀菌剂类型较多，发展快，其重要的品种类型有：
　　1. 酰苯胺类衍生物：该类杀菌剂的结构中含有一个酰苯胺基。又分为两小类，一类是N－取代二甲亚胺类，二类是N－酰基－α－氨基酸类。该类杀菌剂包括纹枯利（菌核净，Dimerhachlone）、菌核利（Dichlozoline）、乙烯菌核利（Vinclozolin）甲霜灵（metalaxyl）、异菌脲（Iprodione）等常见品种。
　　2. 丁烯酰胺衍生物：其分子结构中含有丁烯酰胺的基本骨架，多为内吸杀菌剂。最代表品种是萎锈灵（Oxathiin）和氧化萎锈灵（Oxycarboxin）。
　　3. 三氯乙基酰胺衍生物：品种较少，主要有嗪胺灵（Triforine）和苯胺灵（Chleraniformethane）。
　　4. 吡啶衍生物：分子中含有吡啶环，代表品种有：吡氯灵（Pyroxychlor）。
　　5. 嘧啶衍生物：结构中含有嘧啶环，主要品种有甲菌定（Dimethirol）和乙菌定（Ethirimate）和磺菌定（Bupirimate）。
　　6. 吗啉衍生物：分子结构中含有吗啉环。代表品种有：十三吗啉（Tridemorph）、吗菌灵（Dodemorph）和丙菌灵（Fenpropimorph）等。
　　7. 苯并咪唑衍生物：结构中含有苯并咪唑母核。常见品种有：多菌灵（Carbendazim）、苯菌灵（Benomyl）、甲基托布津（Thiophanate-methy）等。
　　8. 三唑衍生物：分子结构中含有一个N－取代的三氮唑母核。代表品种有：三唑酮（Triadimefon）、多效唑（Paclobutrazol）、丙环唑propiconazole等。
　　9. 异噁唑及异噻唑衍生物：品种较少，主要有立枯灵（Hymexazol）等。
　　在以上类型中吡啶类、嘧啶类、咪唑类、哌嗪类、三唑类和吗啉类等六大类又常称为甾醇生物合成抑制剂类。甾醇是真菌细胞膜的重要组成部分，影响甾醇生物合成的杀菌剂会使菌体细胞膜的功能受到破坏，最终导致细胞死亡。在二十世纪八十年代，甾醇生物合成抑制剂成为内吸性杀菌剂的开拓性的新领域。甾醇生物合成抑制剂具有强的向顶性传导活性和明显的熏蒸作用，杀菌谱广、高效、低用量、药效期长等优点，所以已经成为杀菌剂的主要品种类型。
　　10.4.2 甲霜灵的残留分析
　　该药剂属于酰苯胺类衍生物中的N-酰基-α-氨基酸类，其残留分析主要有气相色谱和高效液相色谱两种测定方法。
　　1. 气相色谱方法
　　⑴. 方法原理
　　样品用甲醇振荡提取，二氯甲烷液－液分配，酸性氧化铝柱层析净化、气相色谱法（NPD）测定。
　　⑵. 样品处理
　　①. 提取
　　将黄瓜纵向切开，每条取1/4，组织捣碎机捣碎。称40g匀浆后的黄瓜样，（土样为20g，加水10mL），放入250mL锥形瓶中，加入80mL甲醇，加塞，在振荡机上振荡提取1h，过滤，滤渣再用80mL甲醇提取1h，过滤，用甲醇多次冲洗滤渣，合并滤液。
　　②. 净化
　　液－液分配：将提取液转移到500mL分液漏斗中，加150mL水，20mL饱和氯化钠水溶液，用2×50mL的二氯甲烷提取。提取液通过装有无水硫酸钠的漏斗干燥，二氯甲烷转移到250mL圆底烧瓶中，在55℃的水浴上浓缩至2～3mL，再用氮气流吹至微干。
　　柱层析：玻璃层析柱中底部塞上玻璃棉，然后依次加入2cm厚无水硫酸钠，10g酸性氧化铝（100～200目。用前在130℃下烘12h，冷却后，加10％水脱活），2cm厚无水硫酸钠。用10mL的二氯甲烷将上述的浓缩物转移到层析柱中，用石油醚/乙醚（9:1，V/V）的混合液淋洗，弃去淋出液。再用50mL石油醚/乙醚（1:1，V/V）的混合液淋洗，收集在250mL圆底烧瓶中,在55℃水浴上浓缩至近干，再用氮气流吹干。用正己烷溶解，定容后待测。
　　⑶. 气相色谱测定
　　检测器：碱火焰离子化检测器（NPD）；色谱柱：1m（长）×2mm（内径）玻璃柱；担体：Chromosorb GAM，80～100目；固定液：3％PEG 20M；检测温度：色谱柱220℃，检测器250℃，进样口250℃；载气：氮气（≥99.99％），30mL/min；燃烧气：氢气32mL/min，空气88mL/min；保留时间：1min12s。该方法的最小检出量：2.7×10-10g；最低检出浓度：黄瓜为0.013mg/kg，土壤为0.018 mg/kg。回收率：添加0.05～0.25 mg/kg，黄瓜回收率为98.0～98.5％，土壤为94.5％。
　　2. 高效液相色谱方法
　　⑴. 方法原理
　　样品用甲醇振荡提取，二氯甲烷液－液分配，酸性氧化铝柱层析净化，高效液相色谱法测定。
　　⑵. 样品处理
　　①. 提取
　　称取50g切碎的葡萄样品（土样为20g，加水10mL），放入250mL锥形瓶中，加入70mL甲醇，加塞，在振荡器上振荡1h，过滤，用甲醇多次洗涤滤渣，合并滤液。
　　②. 净化
　　液-液分配净化：将上述提取液转移到500mL分液漏斗中，加100mL的蒸馏水和40mL饱和氯化钠水溶液，用3×50mL的二氯甲烷提取，提取液经无水硫酸钠脱水，二氯甲烷转移到250mL圆底烧瓶中，在45℃的水浴上浓缩至1～2mL，再用氮气流吹至微干。
　　柱层析净化：层析柱上下两端各放1cm厚无水硫酸钠，中间装填7g酸性氧化铝（小于80目，用前在550℃下烘4h，冷却后加入10％水脱活），用10mL石油醚预淋，再用10mL石油醚将上述浓缩液转移至柱中，用50mL石油醚/乙醚（9:1，V/V）的混合液淋洗，弃去淋出液。再用50mL石油醚/乙醚（1:1，V/V）的混合液淋洗，收集淋出液于250mL圆底烧瓶中，在45℃的水浴上减压浓缩至干。再用重蒸的甲醇溶解，定容后待测。
　　⑶. 高效液相色谱测定
　　检测器：紫外检测器（UV，波长220nm）；色谱柱：30cm（长）×4mm（内径）C18不锈钢柱；流动相：甲醇/水（80:20，V/V）；流速：1mL/min；保留时间：5min48s。该方法的最小检出量：1.6×10-10g；最低检出浓度：葡萄0.08 mg/kg，土壤为0.02mg/kg；回收率：葡萄中添加甲霜灵0.1～2.0 mg/kg，回收率为79.4％～85.5％。土壤中添加0.5～2.0 mg/kg，回收率为85.5～95.8％。
　　10.4.3 乙烯菌核利的残留分析
　　该药剂属于酰苯胺类衍生物中的N－取代二甲酰亚胺类。
　　1. 方法原理
　　样品用丙酮提取，二氯甲烷分配，中性氧化铝/弗罗里硅土柱层析净化，用GC-ECD测定。
　　2. 样品处理
　　⑴. 提取
　　称取20g黄瓜捣碎样品（或过筛土样20g），加入50mL丙酮，振荡提取30min，过滤，用3×30mL丙酮洗涤合并全部提取液，浓缩至约10mL。将提取液转移至分液漏斗中（内盛2％Na2SO4水溶液50mL），用3×30mL二氯甲烷振摇液液分配，合并二氯甲烷液，并经无水硫酸钠干燥，浓缩至2～3mL。
　　⑵. 柱层析净化：
　　层析柱中上下两端各加2cm厚无水硫酸钠，中间上部加4g弗罗里硅土（60～100目，用前经130℃活化6h），下部加4g中性氧化铝（100～200目，用前经130℃活化4～6h），用30mL淋洗液（二氯甲烷/乙酸乙酯，10:1，V/V）预淋，将样品浓缩液转移至柱中，用60mL淋洗液淋洗，收集淋出液并浓缩，定容后待测。
　　3. 气相色谱测定
　　检测器：电子捕获检测器（ECD，Ni63）；色谱柱：25m（长）×0.25mm（内径）毛细管柱，固定液：OV-1701；检测温度：色谱柱200℃，检测器250℃，进样口250℃；载气：氮气（≥99.99％），流速50mL/min，尾气50mL/min；分流比：50:1；保留时间：5min49s。该方法的最小检出量：1.0×10-11g；最低检出浓度：黄瓜为0.005mg/kg，土壤为0.01mg/kg；回收率：黄瓜中添加0.2~5.0mg/kg，回收率为87.5~107.6％；土壤中添加0.2~1.0mg/kg，回收率为85.1~108.7％。
　　10.4.4 异菌脲的残留分析
　　该药剂属于酰苯胺类衍生物中的N－取代二甲酰亚胺类。
　　1. 方法原理
　　水果样品切碎并经组织捣碎后，用丙酮振荡提取，二氯甲烷液－液分配，弗罗里硅土柱层析净化，GC-ECD测定。
　　2. 样品处理
　　⑴. 提取
　　每次取12条香蕉样品，分开果皮果肉，切碎经组织捣碎2min（为方便捣碎可加入适量蒸馏水），折称50g蕉肉，20g蕉皮于500mL具塞磨口三角瓶中，各加100mL丙酮，2~4g助滤剂Celite545，浸泡过夜，振荡提取30min，抽滤，残渣用50、40、30mL丙酮洗涤，抽滤，滤液浓缩去除丙酮。
　　⑵. 液-液分配净化
　　浓缩液转移到500mL分液漏斗中，加5％氯化钠水溶液50mL，加50mL二氯甲烷，振摇1min静止分层后收集下层二氯甲烷，上层液体再加40mL二氯甲烷提取，合并二氯甲烷浓缩至近干，待柱层析。
　　⑶. 柱层析净化
　　层析柱中依次从下至上加入2g无水硫酸钠，5g弗罗里硅土（用前130℃烘6h），0.5g粒状活性炭，2g无水硫酸钠，用40mL二氯甲烷预淋，然后将上述浓缩液用少许二氯甲烷溶解并转移到层析柱中，再用75mL二氯甲烷／乙酸乙酯（19:1，V/V）淋洗，淋出液浓缩近干，用甲苯定容，待测。
　　3. 气相色谱测定
　　检测器：带电子捕获检测器（ECD Ni63）；色谱柱：2m（长）×3mm（内径）玻柱，5％SE-30/Chromosorb W AW DMCS，80~100目；检测温度：色谱柱260℃，检测器350℃，进样口300℃；载气：氮气（≥99.99％）， 30mL/min ；保留时间：1min20s。该方法的最小检出量：2.0×10-10g；最低检出浓度：香蕉肉0.01mg/kg，香蕉皮0.05mg/kg；回收率：添加0.1～5.0mg/kg，香蕉肉为88.2％～105.8%，香蕉皮为82.3％～103.7%。
　　10.4.5 三唑酮的残留分析
　　该药剂属于三唑衍生物类杀菌剂。本方法适用于测定粮食中三唑酮的残留量。
　　1. 样品处理
　　粮食：称取30.0g粉碎过60目的样品，置于500mL具塞三角瓶中，加80mL丙酮，20mL蒸馏水，浸泡过夜后振荡提取1h，抽滤，残渣用30mL丙酮洗涤两次，合并滤液，浓缩除去大部分丙酮。将提取液转移到250mL分液漏斗中，依次加入50mL蒸馏水，10mL饱和氯化钠水溶液，40mL二氯甲烷，振摇2min。下层有机相移至250mL具塞三角瓶中。水相再用20mL二氯甲烷提取一次，弃去水相，有机相经无水硫酸钠脱水后收集在烧瓶中，在40℃水浴浓缩近干。残留物用丙酮转移到刻度试管中，定容到5mL，供GC测定。
　　2. 气相色谱测定
　　检测器：NPD；色谱柱：1.6m（长）×3mm（内径）玻柱，4％OV-17+4％OV-210/Chromosorb W AW DMCS，80～100目；检测温度：色谱柱220℃，检测器290℃，进样口290℃；载气：氮气（≥99.99％），70mL/min；燃烧气：氢气3.6mL/min，空气160mL/min。该方法的最小检出量：三唑酮2.8×10-10g，三唑醇为5×10-10g；最低检出浓度：三唑酮为0.01mg/kg，三唑醇为0.02mg/kg；添加浓度0.04~5.0 mg/kg的回收率在84.1%~103%。
　　10.4.6 丙环唑的残留分析
　　该药剂属于三唑衍生物类杀菌剂。该方法用于小麦、植株、土壤中丙环唑的残留量分析。
　　1. 方法原理
　　样品用甲醇/水提取，经液－液分配，碱性氧化铝柱层析净化，气相色谱法（NPD或ECD）测定。
　　2. 样品处理
　　⑴. 提取
　　称20g小麦籽粒粉碎样品（或20g土壤样品，或10g植株样品），置于500mL具塞三角瓶中，加200mL甲醇/水（8:2,V/V）混合溶液浸泡过夜，振荡提取2h。提取液通过布氏漏斗过滤。再用2×40mL溶剂重复提取。用少量溶剂洗涤三角瓶及滤渣，合并全部滤液。
　　⑵. 液－液分配净化
　　将上述的滤液转入1000mL分液漏斗中，加200mL蒸馏水，50mL饱和氯化钠水溶液，用2×75mL二氯甲烷提取2次，收集二氯甲烷相，通过装有无水硫酸钠的漏斗，二氯甲烷收集后，在旋转蒸发器40℃水浴上浓缩近干。
　　⑶. 柱层析净化
　　层析柱底部塞入玻璃棉球，加入20mL石油醚，然后依次加入2cm厚无水硫酸钠，10g碱性氧化铝（用前650℃灼烧3h，冷却后每100g加19g蒸馏水，在旋转浓缩器中转动3h或振荡2h，储于磨口瓶中，置于干燥器内保存），2cm厚无水硫酸钠，待石油醚刚刚没过硫酸钠时，立即将上述浓缩液用2mL甲苯溶解并转入柱中，再用2×2mL甲苯洗瓶及柱壁二次，然后用50mL石油醚/二氯甲烷（6:4，V/V）淋洗、弃去淋出液；用75mL二氯甲烷／石油醚（6:4，V/V）淋洗并收集与旋转浓缩瓶中，在旋转蒸发器40水浴上蒸去溶剂，改用石油醚／乙醇（1:1，V/V）溶解残渣并准确定容至2mL，待测。
　　3. 气相色谱测定
　　检测器：氮磷检测器（NPD）；色谱柱：1m（长）×3mm（内径）玻柱；担体：Chromosorb Q，80～100目；固定液：3％Carbowax 40M；检测温度：色谱柱230℃，检测器250℃，进样口250℃；载气：氮气（≥99.99％），40mL/min；燃烧气：氢气3mL/min，空气100 mL/min；保留时间：3min36s。该方法的最小检出量：2.7×10-10g；最低检出浓度：0.01~0.03mg/kg；回收率：添加0.1~2.0 mg/kg，回收率在90.3％~94.1％。
　　10.4.7腈苯唑的残留分析
　　该药剂属于三唑衍生物类杀菌剂。本方法适用于土壤及水果中腈苯唑的残留分析。
　　该药剂在环境中容易光解产生两种代谢物：RH-9129和RH-9130。在残留分析中要测定母体及代谢物。
　　1. 样品处理
　　⑴. 提取
　　称取20g水果匀浆样品或20g土壤样品，加80mL甲醇（土壤需先加水10mL），振荡30min，用60目石英砂作助滤剂抽滤，滤渣再用80mL甲醇分多次冲洗滤渣并抽滤，合并滤液。甲醇提取液中加180mL水，5mL醋酸铅饱和溶液，25mL氯化钠饱和溶液，摇匀，静置，用另一抽滤漏斗垫石英砂抽滤，再用30mL二氯甲烷冲洗滤渣并抽干。将甲醇及二氯甲烷滤液转入800mL分液漏斗中，加二氯甲烷50mL×2液-液分配，取二氯甲烷层过无水硫酸钠脱水后，在60℃水浴中减压浓缩至近干，用氮气流吹干溶剂。
　　⑵. 柱层析净化
　　湿法装柱，层析柱上下两端加2cm厚无水硫酸钠，中间加8g层析用硅胶，用10mL丙酮／石油醚（1:9,V/V）混合溶液将提取液移入柱中，再用50mL丙酮/石油醚（4:6,V/V）混合溶液淋洗，收集此部分淋出液并浓缩至干，定容后待测。
　　2. 气相色谱测定
　　检测器：氮磷检测器（NPD）；色谱柱：15m（长）×0.53mm（内径）石英交联毛细管柱，固定液为DB-35；检测温度：色谱柱250℃，检测器270℃，进样口270℃；载气：氮气（>99.99%），14mL/min；燃烧气：氢气4mL/min，空气180mL/min；尾吹气：氮气18mL/min；保留时间：腈苯唑为5.33min，RH-9130为6.33min，RH-9129为6.85min。该方法的最低检出量：1×10-10g；最低检出浓度：0.01mg/kg；回收率：水果、土壤中添加腈苯唑、RH-9130、RH-9129 0.1~1.0mg/kg，回收率分别在82.4%~95.3%。相对标准偏差在0.2%~11.6%。
　　10.5  农用抗生素
　　10.5.1 概述
　　自从1928年发现青霉素，1944年发现链霉素以来，抗生素得到了很快的发展，在农业上也得到了广泛的应用。当前农用抗生素的来源已经由单纯的微生物产生的次生代谢产物，扩展到以微生物产生的活性物质为模板，进行生物合成或结构改造，人工合成抗生素类杀菌剂。目前常用的品种有井冈霉素、公主岭霉素、灭瘟素、多抗霉素等。本节以多抗霉素为例，介绍该类杀菌剂的残留分析。
　　10.5.2 多抗霉素在苹果及土壤中的残留分析
　　1. 方法原理
　　样品用甲醇提取，浓缩物过交换树脂柱、活性炭柱层析净化，最后以灭菌水定容，待测。
　　2. 主要仪器设备及主要试剂
　　高速捣碎机、旋转蒸发仪、高速离心机、培养皿、不锈钢圈。
　　甲醇、乙醇、苯胺、柠檬酸，均为分析纯；磷酸氢二钠、氢氧化钠为优级醇；灭菌水；活性炭：（1g活性炭放入100mL烧杯中，加入50mL水，煮沸3min，室温下放置30min，慢慢倾斜出去为粒浮物）；多氧霉素标准样品：纯度1470A.M.U/mg
　　3. 样品处理
　　苹果：称取100g样本置于高速捣碎机中，加150mL甲醇，捣碎3min。抽滤，用100mL甲醇/水（7:3,V/V）洗涤滤渣，合并滤液于圆底烧瓶中，移至旋转蒸发仪40℃水浴上浓缩近50mL，用盐酸调节至pH2.0，高速离心15min；除去沉淀物，滤液以1.5mL/min 过20×200mm的交换树脂柱，将20mL树脂装入柱子，60mL 1/5M柠檬酸／磷酸氢二钠缓冲液（pH2.0）淋洗，再用60mL水淋洗。然后依次用60mL水1.5mL/min、1000 mL 丙酮／水（1:1,V/V）1mL/min、60 mL 水1.5mL/min淋洗此柱。弃去淋洗液。再用200 mL 0.3mol/L 盐酸以0.7mL/min淋洗该柱。溶出Polyoxin B。用氢氧化钠溶液调节淋洗液至pH6.0，淋洗液以2mL/min速率通过15×200min的活性炭柱。再依次用200mL0.01%苯胺溶液、200mL水，以1.5mL/min速率淋洗。再用50mL水2mL/min、1000mL水／乙醇（59:5，V/V）1.5mL/min淋洗此柱，弃去淋出液。用200mL丙酮／水（3:2,V/V）以1.5mL/min速率淋洗，淋洗液收集于圆底烧瓶中，在旋转蒸发器40℃水浴上浓缩近干，用灭菌水定容，待生物测定。试液浓度Polyoxin B超过1AmU单位时，应该用灭菌水稀释。
　　土壤：称取50g样品放入三角瓶中，加40mL 1M磷酸氢二钾溶液,置于振荡器上振荡30min，抽滤，合并滤液。用盐酸调至pH6.0 放于冰箱中过夜（5℃），除去沉淀物。滤液以2mL/min的速率通过15×200mm活性炭柱，50mL水以1mL/min速率淋洗，弃去淋出液再用400mL丙酮/水（3:2,V/V）0.5mL/min速率淋洗，并收集于圆底烧瓶中，于旋转蒸发器40℃左右的水浴上浓缩至近干，用20mL灭菌水定容，待测。
　　4. 生物法测定
　　制备孢子悬浮液：在培养（28℃）7~10天的苹果轮斑病菌（AlternaninmaliAK1-3）斜面试管内加5mL灭菌水，用接种环轻轻划动斜面上的菌丝，使孢子悬浮于灭菌水中，用灭菌纱布过滤于三角瓶中制成一定浓度的孢子悬浮液。
　　平面制作：将测定用的培养基熔化，并冷却至45℃左右加入适量孢子悬浮液，充分混合后迅速取5mL注入灭菌的9cm培养皿内，轻轻摇动培养皿使其形成均匀带菌培养基平面。
　　SH
　　UL
　　SL
　　UH
　　“SH”内注入1A?m?u（效价）/ml标准液
　　“SL”内注入0.5A?m?u（效价）/ml标准液
　　“UH”内注入高浓度的试液
　　“UL”内注入1/2高浓度试液
　　加样：培养基平面凝固后，按下图位置放置不锈钢圈（内径6mm，高10mm），并注入表样各试液。
　　恒温培养：加样后的平面培养基放冰箱（4℃）中，5h（让药剂充分扩散）后取出，置28℃恒温箱中培养38～45h，取出测量抑菌圈直径。
　　5. 结果计算
　　将培养38～45h的培养基平面取出，精确测量抑菌圈直径（mm，精确至0.5mm），然后按下列公式计算残留量和回收率。
　　LogQ=
　　（UH、SH、UL、SL代表抑菌圈直径）
　　Q＝PU/PS
　　（PU为试液高浓度的效价，单位是A·m·u/mL）
　　（PS为标准液高浓度的效价，单位是A·m·u/mL）
　　PU=QPS（PS为1A·m·u/mL）
　　残留量（mg/kg）=
　　校正后残留量（mg/kg）=残留量／回收率
　　该方法最低检出浓度：0.05mg/kg；回收率：苹果0.5~1.0mg/kg回收率为74~79%，土壤添加0.1～1.0mg/kg回收率为80～81%；变异系数：苹果2.5～4.1%，土壤5.0～8.7%。