标题桑叶抗焦虑作用研究之动物焦虑实验

桑叶抗焦虑作用研究之动物焦虑实验

摘 要：目的：利用焦虑动物模型研究桑叶抗焦虑作用及其物质基础。方法：将小鼠随机分为空白对照组（蒸馏水 0.375 mL）、地西泮对照组（0.0023 g/kg）、桑叶组（4.5 g/kg）、真空处理桑叶组（4.5 g/kg），每组 10只，雌雄各半，灌胃给药，1 次/d，连续灌胃 4 d 后，依次采用自主活动仪、明暗箱、高架十字迷宫考察药物对小鼠的行为影响；高效液相色谱法（HPLC）检测行为学实验后小鼠脑神经递质含量。结果：与空白对照组比较，真空处理桑叶组可显著增加小鼠在明箱停留时间（P<0.05），并显著提高小鼠开臂滞留时间百分比（OT％）（P<0.05）。小鼠脑内神经递质检测显示，真空处理桑叶组、桑叶组均可显著降低小鼠脑组织 5-羟色胺（5-HT）浓度（P<0.05），去甲肾上腺素（NE）、多巴胺（DA）浓度也有降低，但无统计学差异。结论：桑叶具有抗焦虑作用，且其物质基础可能为 γ-氨基丁酸（GABA）。

关键词：桑叶；抗焦虑；γ-氨基丁酸；明暗箱；高架十字迷宫

焦虑症是一种具有持久性焦虑、恐惧、紧张情绪和植物神经活动障碍的脑机能失调，常伴有运动性不安和躯体不适感。临床治疗焦虑症的药物主要有苯二氮卓类、非苯二氮卓类、抗抑郁药以及肾上腺受体阻滞剂等，尽管这些药物见效快、疗效好，但易产生耐受性，长期应用可产生依赖性及突然停药产生戒断反应等。因此，寻找一种安全有效的抗焦虑药物迫在眉睫。

桑叶是一种药食两用产品，治病入药始于东汉，具有疏散风热、清肺润燥、平肝明目、凉血止血的功效。现代药理研究证明桑叶具有降血糖、降血压、抗菌、抗病毒等作用[3，4]，但对桑叶抗焦虑作用的研究报道极少。笔者等运用自主活动仪、明暗箱和高架十字迷宫多种焦虑动物模型观察桑叶的抗焦虑作用，并初步探究其抗焦虑作用的物质基础。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF 级昆明种小鼠，初始质量 18-22 g，雌雄各半，购自重庆市第三军医大学实验动物中心。

1.2 药物与试剂

桑叶，采自重庆北碚西南大学桑之源基地，经西南大学李学刚教授鉴定；地西泮片剂（华中药业股份有限公司，批号：20120601）；去甲肾上腺素（美国 Sigma 公司，批号：1001423402）；多巴胺（美国 Sigma 公司，批号：101171997）；5-羟色胺（美国 Sigma 公司，批号：1001344074）；无水乙醇（AR）；磺基水杨酸；高氯酸（AR）；乙酸钠（色谱纯）；乙酸（AR）；甲醇（色谱纯）；乙二胺四乙二钠盐。

1.3 仪器

LC-6AD 高效液相色谱仪（日本岛津公司）；Auanti J-30I 高速冷冻离心机（美国贝克曼库尔特公司）；XR-XZ301 自主活动仪（上海欣软信息科技有限公司）；自制明暗箱；XR-XG201 十字迷宫跟踪分析系统 （上海欣软信息科技有限公司）；台式低速大容量离心机（上海菲恰尔分析仪器有限公司）；SHZ-Ⅲ型循环真空泵（上海亚荣生化仪器厂）；旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；JA2003B 电子天平（上海精天电子仪器有限公司）；F6/10-6G 超细匀浆器 （弗鲁克流体机械制造有限公司）。

1.4 方法

1.4.1 真空处理的桑叶水提醇沉浸膏的制备 取新鲜桑叶 500 g，置于真空装置中，于 20 ℃静置 8 h。用蒸馏水回流提取 3 次，合并，减压浓缩到 150-200 mL，添加 3 倍体积的 95%乙醇，放置冷却 12 h 以上，过滤，上清液减压浓缩至 200 mL 左右，备用。

1.4.2 动物分组及给药 取 40 只 SPF 级昆明种小鼠，雌雄各半，随机分为空白对照组（蒸馏水 0.375 mL）、阳性药物地西泮对照组（0.002 3 g/kg）、桑叶组（4.5 g/kg）、真空处理桑叶组（4.5 g/kg）共 4 组，每组 10 只。桑叶、真空处理桑叶制成水提醇沉浸膏后给药，连续灌胃给药 6 d，1 次/d。

1.5 行为学实验

1.5.1 桑叶对小鼠自主活动行为的影响 在第 4 天灌胃后分别于 0 h、1 h、2 h、3 h 将小鼠放入自主活动仪中测定 5 min 内小鼠的活动次数和站立次数。

1.5.2 桑叶对小鼠明暗箱行为的影响 在第 5 天灌胃 30 min后，将小鼠置于明暗箱的明箱中央，头朝暗箱，记录 5 min内小鼠的穿箱次数、小鼠在明箱的滞留时间及跨格次数。

1.5.3 桑叶对小鼠高架十字迷宫行为的影响 在第 6 天灌胃后的 30 min，将小鼠置于迷宫中央，头朝闭臂。分别记录 5 min 内小鼠进入开放臂和封闭臂的次数、停留时间

及在两臂滞留的总时间。计算小鼠进入开臂的次数占总入臂次数（进入开臂和闭臂的次数之和）的百分率（OE%）及在开臂滞留时间占总入臂时间（在开臂和闭臂滞留时间之和）的百分率（OT%）。

1.6 小鼠脑组织内 NE、DA、5-HT 含量测定

1.6.1 样品预处理 行为学实验后，立即断头处死小鼠，迅速取出脑组织，称重后放入已加 500 μL 0.4 mol/LHClO4的 Ependet 离心管中，冰浴匀浆。涡旋后置冷冻离心

机 （4 ℃），10 000 r/min 离 心 10 min， 将 上 清 液 转 入Eppen-dorf 离心管中，再次离心，取上清液，用 HPLC 法测定脑组织中 NE、DA、5－HT 含量。

1.6.2 色谱条件 色谱柱为 Hypersil ODS2高效液相色谱柱 （4.6 mm × 200 mm，5 μm）。流动相为 0.1 mol/L 的CH3COONa 缓 冲液 - 甲醇（9 ∶1），流速 1.0mL/min，进样量每次 20 μL。发射波长 330 nm，激发波长 290 nm。柱温：25 ℃。1.7 统计学处理用 SPSS17.0 软件对数据进行统计，采用单因素方差分析 （One-way ANONA） 进行检验，多组间比较采用Duncan’s Test 检验，数据以 X±S 表示。

2 结果

2.1 桑叶对小鼠自主活动的影响

与空白对照组比较，药物组在灌胃后 2 h，小鼠在自主活动仪中的活动次数和站立次数均减少，且真空处理桑叶组与空白对照组有显著性差异（P<0.05）。结果见表 1。

2.2 桑叶对小鼠明暗箱行为的影响

与空白对照组比较，药物组均能增加小鼠跨格次数、在明箱的滞留时间。两个桑叶组小鼠在明箱内的跨格次数与空白对照组比较差异显著（P<0.05）。同时，真空处理桑叶组小鼠在明箱滞留时间与空白对照组比较差异显著（P<0.05）。结果见表 2。

2.3 桑叶对小鼠高架十字迷宫行为的影响

与空白对照组相比，药物组均能增加小鼠开臂进入次数百分比（OE%）、开臂滞留时间百分比（OT%）。地西泮组及真空处理桑叶组 OE%、OT%与空白对照组比较均有显著性差异（P<0.05）。结果见表 3。

2.4 桑叶对小鼠脑组织中神经递质含量的影响与空白对照组相比，药物组小鼠脑组织中 NE、DA、5-HT 含量均降低。两个桑叶组小鼠脑组织中 5-HT 含量与空白对照组比较有显著性差异 （P<0.05）。结果见表 4，HPLC 色谱见图 1。

3 讨论

桑叶中 GABA 的平均含量可达 2.26 mg/g，真空处理后的桑叶中 GABA 的含量将会增加。GABA 是中枢神经系统中含量最多、最重要的抑制性神经递质，通过与下一个神经元膜上的受体结合，开放氯离子通道，使氯离子内流，使细胞膜超极化，抑制动作电位的发生，从而阻止焦虑相关的信息抵达脑指示中枢。本研究结果显示，桑叶和真空处理后的桑叶对小鼠的中枢神经系统均有抑制作用，且后者作用强于前者，说明桑叶中 GABA 含量越高，其抑制作用越明显。明暗箱、高架十字迷宫都是评价药物抗焦虑作用的经典实验模型。桑叶水提醇沉浸膏和真空处理后的桑叶水提醇沉浸膏都表现出对小鼠的抗焦虑作用，且真空处理后的桑叶组较空白对照组有显著性差（P<0.05），说明桑叶中的 GABA 含量越高，其抗焦虑作用越明显。5-HT 是与心境障碍相关的关键性神经递质，目前研究认为 5-HT 的多个受体皆与焦虑障碍有密切关系。其中，5-HT3受体属于配体门控离子通道偶联受体，激活 5-HT3受体可以开放阳离子通道而触发细胞快速去极化，导致胞浆内钙离子浓度迅速升高，继而诱发神经元释放递质。而抑制性神经递质 GABA 使细胞膜超极化，不容易去极化，导致 5-HT3受体不能激活，从而抑制 5-HT 释放。此外，5-HT1B、5-HT2C与 GABA 也有相互调节作用。同时，焦虑症的产生还与 NE、DA 的释放有关，已有动物实验发现，焦虑模型小鼠脑组织内的NE、DA、5-HT 都有升高，而使用抗焦虑药物的小鼠脑内这 3 种神经递质水平会降低。本研究用 HPLC 色谱法分析行为学实验后的小鼠大脑中 NE、DA、5-HT 含量，药物组 3 种神经递质含量较空白组均降低，证明了桑叶的抗焦虑作用。

综上所述，桑叶抗焦虑作用可能是桑叶中的 GABA 作用于中枢神经系统，与 NE、DA、5-HT 协同作用阻碍焦虑信息的传达，从而产生抗焦虑作用，具体机理有待进一步研究。