标题紫外分光光度法测定鹰嘴豆和豆芽中异黄酮含量的研究

【摘要】 目的建立一种检测鹰嘴豆异黄酮含量的快速分析方法，并检测鹰嘴豆和豆芽中异黄酮的含量。方法采用紫外分光光度法，检测波长为260.9 nm，测定鹰嘴豆及其豆芽中异黄酮的含量测定。结果鹰嘴豆芽素A在2～30 μg/ml范围内吸光度与浓度呈良好的线性关系，以黄酮总含量测定结果重复性RSD=1.95%，加样回收率为100.18%。结论为鹰嘴豆提取物及制品提供一种简单、可靠、有效的测定方法。

　　【关键词】 鹰嘴豆 豆芽 异黄酮 紫外分光光度

　　鹰嘴豆是豆科鹰嘴豆属鹰嘴豆Cicer afiefinum L．的成熟种子，为一年生栽培植物，维吾尔语称其为诺胡提（音译），主要种植在新疆、甘肃等地区，是维吾尔族人常用的药食两用的食品，有治疗糖尿病、高脂血症、支气管炎、性欲降低等疾病的作用。

　　有关鹰嘴豆中异黄酮的报道不多，谭永霞等［1］从鹰嘴豆中分离得到异黄酮，关于鹰嘴豆异黄酮的含量测定及其方法均未见报道。本研究用自制的鹰嘴豆芽素A为标准品，在紫外最大吸收峰260.9 nm处测定了鹰嘴豆和其豆芽异黄酮含量，豆芽中异黄酮含量达到5.057%，并确定了鹰嘴豆异黄酮含量测定方法。

　　1 材料与仪器

　　鹰嘴豆为木垒县产的“Desi”品种，豆芽经常规发芽得到，鹰嘴豆豆芽素A对照品为本实验室分离制备；试剂均为分析纯。

　　SHIMADZU UV-2550型分光光度计；戴安P680高效液相色谱仪；UVD170u型紫外检测器；Chromeleon型色谱工作站；超声波清洗器（KQ-250B型）；电子天平（SEJ180-4型）。

　　2 方法

　　2.1 样品液的制备精确称取2.0 g鹰嘴豆粉和干燥后的鹰嘴豆豆芽粉（过25目筛），每一样品平行作两份，溶于20 ml的甲醇中，采用超声波提取3次，功率为59 kHz，温度为25℃ ，提取时间为45 min，过滤，合并滤液，测定吸收值，每一样品测3次，取6个测定的吸收值均值为该样品的吸收值。

　　2.2 标准品的制备和标准溶液的配制

　　2.2.1 标准品的制备鹰嘴豆豆芽提取物经硅胶柱、SephadexLH20层析后得到化合物，再经制备HPLC进一步纯化，归一法其纯度为98.96%，经1H-NMR，13C-NMR结构鉴定：黄色针状结晶，mp 216～217℃（CH3OH）。 H-NMR（DMSO-d6）6： 8．35（1H，s，H-2），7．49（2H，d，J=8．4 Hz，H-2 ，6 ），6．99（2H，d，J=8．7 Hz，H-3 ，5 ），6．41（1H，d，J=2．1 Hz，H-8），6．24（1H，d，J=1．8 Hz，H-6），3．78（3H，s，OCH3）；13C-NMR（DMSO-d6）6：154．4（C-2），122．7（C-3），179．9（C-4），161．5（C-5），98．7（C-6），163．9（C-7），93．6（C-8），157．5（C-9），104．3（C-10），121．9（C-1 ），130．0（C-2 ），113．6（C-3 ），159．0（C-4 ），113．6（C-5 ），130．0（C-6 ），55．0（OCH3）。以上数据与文献［2］一致，故鉴定化合物为鹰嘴豆芽素A（biochanin A）。

　　HPLC制备色谱条件：ODS-A色谱柱（250 mm×20 mm，5 μm）；流动相MeOH-H2O（80∶20）；进样量 1 ml；流速7 ml/min；检测波长260 nm。色谱图见图1。

　　2.2.2 标准溶液的配置精确称取已纯化的鹰嘴豆芽素A标准品5.0 mg，置于25 ml容量瓶中，以甲醇溶解，并定容至刻度，摇匀，浓度为200 μg/ml。

　　2.3 波长的选择分别取一定浓度的标准溶液和样品液，在波长为200～400 nm的紫外区范围进行扫描，测定参数为Abs，中速，采样间隔为1 nm，记录范围-1.638～4.000，根据紫外吸收光谱图确定其测定波长。

　　 2.4 标准曲线的绘制精确吸取0.10，0.20，0.40，0.50，1.00，1.50 ml标准品溶液分别置于6个10 ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。以甲醇作空白对照，在波长最大吸收峰处测定吸光度，得到以鹰嘴豆芽素A溶液浓度C为横坐标、吸光度值A为纵坐标的标准曲线，用最小二乘法进行线性回归，可得标准曲线方程。

　　3 结果

　　3.1 检测波长的确定鹰嘴豆异黄酮结构中羟基和芳环形成较强的共轭体系，对紫外光有较强的特征吸收，故选择紫外区进行波谱扫描。鹰嘴豆芽素A标准溶液的最大吸收波长在260.9 nm处，样品液的最大吸收波长也在260 nm处，两者的最大吸收波长基本没有偏差，故选择260.9nm处作为测定波长。见图2。

　　3.2 标准曲线方程在260.9 nm处测定一系列鹰嘴豆芽素A标准溶液的吸光度值，以吸光度A为纵坐标，浓度C为横坐标，求得回归方程Y=0.1218 0X 0.064 18，相关系数r=0.999 5，鹰嘴豆芽素A在2.00～30.00 μg／ml范围呈良好线性关系。3.3 鹰嘴豆和其豆芽异黄酮的含量在紫外最大吸收峰260.9 nm下，测的鹰嘴豆和豆芽的异黄酮含量，每个样品测3次，2个平行样。测得结果：鹰嘴豆异黄酮含量为0.016%；鹰嘴豆豆芽异黄酮含量为5.057%。

　　3.4 稳定性实验分别取一定量新鲜配制的标准溶液和样品溶液，在动力学窗口，吸收波长260.9 nm下测定其吸收值，观察其稳定性，每隔15 min取一测定值。结果放置7 min测得的吸光度值稳定不变；将放置7 min测得的吸光度值作为0 min，并每隔30 min测定1次，结果标准溶液在所试3 h内相对标准偏差RSD=0.8％，样品溶液在所试3 h内RSD=1.3％。实验表明，鹰嘴豆芽素A标准品溶液和鹰嘴豆提取样品液在所试3 h内稳定。

　　3.5 重复性实验将在一定工艺条件下所得的提取鹰嘴豆提取液随机取6份，作为样品溶液，分别测定吸光度值，根据标准曲线方程求得对应浓度，经统计学处理，其RSD=1.95％。实验结果表明，本方法的重复性较好。

　　3.6 精密度实验在线性范围内，同一样品6次平行测定的相对标准偏差RSD< 0.1％。实验表明，该方法的精密度较高。

　　3.7 加样回收率实验精密吸取0.8，1.0，1.4，1.6，2 ml鹰嘴豆芽素A标准溶液于5只25 ml容量瓶中，再分别精密加入样品溶液5 ml，按测定程序进行测定，计算回收率。所得结果如表1。5个样品的回收率在97.4％ ～103.4％之间，其平均加样回收率为100.18％，RSD为2.1％。表1 回收率实验结果

　　4 讨论

　　以鹰嘴豆芽素A为标准品，采用紫外分光光度法进行鹰嘴豆异黄酮含量的测定，具有方法简便、快速、准确、重复性好等特点，特别适于对提取分离工艺条件的实验研究，无需专用试剂即可测定提取效率、流出曲线等指标，还可考察工艺条件的优劣，故本方法可作为检测鹰嘴豆异黄酮含量的一种有效手段。

　　异黄酮类化合物是广泛存在于豆科植物中的一类生物活性物质，一直被人们用来治疗心血管系统疾病和糖尿病。研究表明，异黄酮具有抗氧化、抗溶血、通过降低血脂和血浆胆固醇来防治心血管疾病的作用，还具有雌性激素样作用，有利于骨质疏松症、更年期综合征、前列腺癌及乳腺癌的预防［3］。本文使用自外分光光度法测得鹰嘴豆中异黄酮含量是0.016%，其豆芽异黄酮含量是5.057%。由结果可以看出鹰嘴豆胚芽中异黄酮的含量要远远高于鹰嘴豆中的异黄酮，几乎是鹰嘴豆中异黄酮的三百多倍。由此，可采用鹰嘴豆发芽这一简单前处理的方法富集鹰嘴豆中的异黄酮，从而有利于鹰嘴豆异黄酮产品的开发。