GE-200液相色谱仪在饲料中替米考星的含量测定应用
本标准适用于混合饲料、浓缩饲料和预混合饲料中替米考星的测定。本标准测定量限（LOQ）为每千克饲料中替米考星2mg。
GB/T 6682 分析实验用水规则和实验方法
仪器设备
GE-200二元高压液相色谱仪，配梯度洗脱SCL-501系统控制器，GE-200液相色谱仪，N2010色谱工作站
色谱柱：Vertex 苯基柱4.6*250,5um
分析天平：感量0.0001g
天平：感量0.01g
振荡器
玻璃具塞三角瓶：250ml
微孔滤膜：孔径0.45um
试剂和溶液
水应符合GB/T 6682三级水的规定
乙腈：色谱纯，磷酸：85%，二丁胺，磷酸二氢钾，磷酸氢二钾
1mol/L磷酸二丁胺缓冲液（DBAP）：在700ml水中加入168ml二丁胺，然后缓慢加入约70ml磷酸，震荡使二丁胺溶解，冷却至室温。调节PH至2.5-5.6（以每次1-2ml的速度加入18ml磷酸）。转移至量瓶中，加水至1000Ml,过滤，备用。
PH6.0磷酸缓冲液：取136g磷酸二氢钾、69g磷酸氢二钾至900ml水中，用磷酸调节PH至6.0±0.2，转移至量瓶中，加水至1000ml
提取液：取200ml乙腈、25mlDBAP,25ml磷酸缓冲液，加水至1000ml
流动相A：乙腈
流动相B：PH2.4-3.0的水（用磷酸调节、过滤）
流动相C：0.02ml/L DBAP溶液。取20ml 1mol/L DBAP溶液，加水至1000ml，过滤即得
替米考星标准溶液：将替米考星对照品在在60℃减压干燥3H，称取400mg（精确到0.0001g），置于100mL棕色容量瓶中，用乙腈溶液、定容，配置成4000ug/ml的贮备液，避光保存。
替米考星标准中间液：准确吸取6.25ml标准贮备液于50ml棕色容量瓶中，用提取液稀释、定容、赔偿成浓度500ug/ml的标准中间液。
替米考星标准工作液：准确吸取一定量的标准中间液于棕色容量瓶中，用提取液稀释、定容至浓度为5、20、40、60、80ug/ml的标准工作液
试样制备
取有代表性的样品至少500g，用四分法缩减至约200g，粉碎通过1mm孔径筛，混匀，贮于磨口瓶中备用
分析步奏
称取试样2g-10g（精确至0.01g）于玻璃具塞三角瓶中，准确加入100ml提取液，振荡器上震荡60Min（震荡速度200r/min）。用滤纸过滤，弃初滤液，收集部分滤液，用微孔滤膜过滤，滤液供高效液相色谱分析。
HPLC色谱条件
色谱柱：Vertex 苯基柱4.6*250,5um
检测波长：280nm
流动相流速：1.5ml/min
进样体积：20uL
流动相：A、B、C，梯度见下表：
时间（min） A% B% C%
0.0 50 50 0
3.0 50 50 0
4.0 15 85 0
5.0 15 0 85
25.0 25 0 75
25.1 50 50 0
30.0 50 50 0
定量测定
测定标准工作液和试样溶液中替米考星峰面积的响应值，用单点或多点校准法定量
